Описаны два связанных метода для визуализации субклеточных событий, необходимых для синаптической передачи. Эти протоколы позволяют в режиме реального времени отслеживать динамику пресинаптического притока кальция и слияния синаптических везикулных мембран с использованием визуализации живых клеток культивируемых нейронов in vitro .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуоресцентное измерение синаптических функций в реальном времени в моделях бокового амиотрофического склероза
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
До дегенерации нейронов причиной двигательного и когнитивного дефицита у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС) и/или деменцией лобно-височной доли (FTLD) является нарушение связи между нейронами и двигательными нейронами и мышцами. Основной процесс синаптической передачи включает мембранно-деполяризационно-зависимое синаптическое слияние везикул и высвобождение нейротрансмиттеров в синапс. Этот процесс происходит через локализованный приток кальция в пресинаптические терминали, где находятся синаптические везикулы. Здесь протокол описывает флуоресцентные методологии визуализации в реальном времени, которые надежно сообщают о деполяризационно-опосредованном синаптическом экзоцитозе везикул и динамике притока пресинаптического терминального кальция в культивируемых нейронах.
Используя стириловый краситель, который включен в синаптические пузырьковые мембраны, выясняется высвобождение синаптических пузырьков. С другой стороны, для изучения поступления кальция используется Gcamp6m, генетически закодированный флуоресцентный репортер. Мы используем высокую деполяризацию, опосредованную хлоридом калия, для имитации активности нейронов. Чтобы однозначно количественно оценить экзоцитоз синаптических пузырьков, мы измеряем потерю нормализованной флуоресценции стирилового красителя как функцию времени. При аналогичных условиях стимуляции, в случае притока кальция, флуоресценция Gcamp6m увеличивается. Нормализация и количественная оценка этого изменения флуоресценции выполняются аналогично протоколу стирилового красителя. Эти методы могут быть мультиплексированы с трансфекционной сверхэкспрессией флуоресцентно помеченных мутантных белков. Эти протоколы широко использовались для изучения синаптической дисфункции в моделях FUS-ALS и C9ORF72-ALS, используя первичные корковые и двигательные нейроны грызунов. Эти протоколы легко позволяют проводить быстрый скрининг соединений, которые могут улучшить нейронную связь. Таким образом, эти методы ценны не только для изучения БАС, но и для всех областей исследований нейродегенеративной и развивающей нейробиологии.
Введение
Моделирование бокового амиотрофического склероза (БАС) в лаборатории становится уникально сложным из-за чрезвычайно спорадического характера более 80% случаев1 в сочетании с огромным количеством генетических мутаций, которые, как известно, являются причинами заболеваний2. Несмотря на это, все случаи БАС объединяет та особенность, что до прямой нейрональной дегенерации существует дисфункциональная связь между пресинаптическими двигательными нейронами и постсинаптическими мышечными клетками3,4. Клинически, поскольку пациенты теряют связность оставшихся верхних и ни....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры для животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Джефферсона.
1. Первичная культура нейронов из эмбриональной коры головного мозга крыс
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные корковые нейроны выделены из эмбрионов крыс E17.5, как описано ранее57,58. С успехом этого протокола культивирования, по-видимому, не существует предвзятости деформации. Этот метод кратко описан ниже. На предыдущие указанные статьи следует ссылаться для получения полной информации.
- Ус....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После успешной реализации вышеуказанного протокола показаны репрезентативные результаты для типичного эксперимента по высвобождению синаптических пузырьков стириловым красителем. Культивируемые первичные корковые нейроны крыс нагружали красителем с использованием метода, описанного в разделе 6. Специфичность загрузки красителя определяли путем совместной маркировки с синаптическим везикулярным маркером синаптофизина. Большинство стириловых красителей положительных пункт являются коположительными для этого маркера (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Три шага, общие для обоих описанных методов, имеют решающее значение для успеха экспериментов и поддающихся количественной оценке результатов. Во-первых, подготовка свежего aCSF перед каждым раундом экспериментов имеет важное значение, следуя прилагаемым инструкциям. Неспособность сделать это может предотвратить соответствующую деполяризацию нейронов. Образец необработанных контрольных нейронов должен постоянно тестироваться перед стимуляцией любых экспериментальных групп, чтобы обеспечить надлежащую клеточную деполяриза.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить нынешних и бывших членов Центра ALS Джефферсона Вайнберга за критические отзывы и предложения по оптимизации этих методов и их анализа. Эта работа была поддержана финансированием nih (RF1-AG057882-01 и R21-NS0103118 to D.T), NINDS (R56-NS092572 и R01-NS109150 to P.P),Ассоциации мышечной дистрофии (D.T.), Центра роберта Паккарда по исследованию БАС (D.T.), фонда Family Strong 4 ALS и Фонда семьи Фарбер (B.K.J., K.K. и P.P.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 20-кратный воздушный объектив | Nikon | Для визуализации | |
| 40-кратный масляный иммерсионный объектив | Nikon | Для визуализации | |
| B27 Добавка | Thermo Scientific | 17504044 | Добавка для роста нейронов |
| BD Шприцы без иглы, 50 мл | Thermo Scientific | 13-689-8 | Часть гравитационной перфузионной сборки |
| Biosafety Капюшон | для клеточной культурыBaker | SterilGARD III SG403A | Культивирование асептических клеток, трансфекция и загрузка красителей |
| b-меркаптоэтанол | Миллипоры Sigma | M3148 | Для культивирования и поддержания нейрональных культур |
| Бычья сыворотка Альбумин | Миллипоры Sigma | A9418 | Для приготовления нейрональных культур |
| Дигидрат хлорида кальция | Миллипор Sigma | 223506 | Компонент растворов aCSF |
| Клеточная культура CO2 инкубатор | Thermo Scientific | 13-998-123 | Для культивирования и поддержания нейронов |
| Центрифуга | Eppendorf | 5810R | Для приготовления культуры нейронов |
| Конфокальный микроскоп | Nikon | Eclipse Ti +A1R core | Для флуоресцентной визуализации |
| CoolSNAP ES2 ПЗС-камера | Фотометрия | Для получения изображений | |
| D-глюкоза | Millipore Sigma | G8270 | Компонент растворов aCSF |
| DNаза | Millipore Sigma | D5025 | Для подготовки культуры нейронов |
| Самка, временная беременность Sprague Dawley крысы | Charles river | 400SASSD | Для получения эмбриональных культур коры головного мозга и спинномозговых мотонейронов |
| FITC Фильтр-куб | Nikon | 77032509 | Для визуализации Gcamp кальциевых переходных процессов |
| FM4-64 стириловый краситель | Invitrogen | T13320 | Для визуализации выделения синаптических везикул |
| Стеклянные дно чашки Петри (Толщина #1.5) | CellVis | D35-10-1.5-N | Для роста нейронов на совместимой с визуализацией культуральной чашке |
| Стеклянная пипетка Пастера | Grainger | 52NK56 | Для приготовления нейрональных культур |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) | Millipore Sigma | H6648 | Для приготовления культур нейронов |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Компонент растворов aCSF |
| Высокообогащенная KCl искусственная жидкость в спинномозговом мозге (aCSF) | Для визуализации. Пожалуйста, смотрите рецепты*лошадиная сыворотка | ||
| Millipore Sigma | H1138 | Для культивирования и поддержания нейронов | |
| Капюшон для рассечения ламинарного потока | NUAIRE | NU-301-630 | Для приготовления нейрональных культур |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | Для приготовления нейрональных культур |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Scientific | 11415064 | Для приготовление нейрональных культур |
| Leibovitz's L-15 Medium, без фенола красного | Thermo Scientific | 21083027 | Для приготовления нейрональных культур |
| L-глутамин (200 мМ) | Thermo Scientific | 25030149 | Добавка для культуры нейронов |
| Lipofectamine 2000 Реагент для трансфекции | Thermo Scientific | 11668019 | Для нейрональных трансфекций |
| Low KCl искусственный цереброспинальный жидкость (aCSF) | Для визуализации. Пожалуйста, смотрите рецепты* | ||
| Хлорид магния | Millipore Sigma | 208337 | Компонент aCSF, решения |
| Microsoft Excel | Microsoft | для анализа/нормализации данных | |
| Nalgene Фильтрующие блоки, 0,2 & микро; m PES | Thermo Scientific | 565-0020 | Фильтрующая установка для раствора аКСФ |
| Нейробазальная среда | Thermo Scientific | 21103049 | Для культивирования и поддержания нейрональных культур |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | Программное обеспечение для захвата и анализа изображений | |
| Nunc 15 мл Конические пробирки | Thermo Scientific | 339650 | Для приготовления культуры нейронов и буфера растворы |
| Nunc 50 мл конические пробирки | Thermo Scientific | 339652 | Для приготовления культур нейронов и буферных растворов |
| Optiprep | Millipore Sigma | D1556 | Для приготовления культур нейронов |
| Papain Millipore Sigma | P4762 | Для приготовления культур нейронов | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | Thermo Scientific | 15140122 | Для предотвращения бактериального загрязнения культур нейронов |
| Перфузионная система | Warner Instruments | SF-77B | Для замены |
| перфузионной трубки | aCSF Cole-Parmer | UX-30526-14 | Часть гравитационной перфузионной сборки |
| pGP-CMV-Gcamp6m плазмида | Addgene | 40754 | Для визуализации переходных процессов |
| кальция Poly-D-лизина гидробромид | Millipore Sigma | P7886 | Средство для покрытия стеклянного дна чашки Петри |
| Хлорид калия | Millipore Sigma | P3911 | Компонент растворов aCSF |
| Бикарбонат натрия | Millipore Sigma | S5761 | Компонент растворов aCSF |
| Хлорид натрия | Millipore Sigma | S9888 | Компонент растворов aCSF |
| Stage Top Инкубатор | Tokai Hit | Для инкубации живых нейронов в период визуализации | |
| TRITC Filter cube | Nikon | 77032809 | Для визуализации FM4-64 |
| Ингибитор трипсина | Millipore Sigma | T6414 | Для получения культур нейронов |
| Trypsin-EDTA (0,25%), фенол красный | Thermo Scientific | 25200056 | Для приготовления культур нейронов |
| Виброизоляционный стол | New Port | VIP320X2430-135520 | Стол/подставка для микроскопа |
Ссылки
- Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
- Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
