Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת Staphylococcus aureus ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

פרוטוקול זה נועד לתאר כיצד לחקור את היקף הפנמת Staphylococcus aureus ואת יכולתה לשרוד בתוך התא המארח האנושי, כמו גם את היעילות התאית של תרכובות מיקרוביאלית.

Abstract

Staphylococcus aureus מבטא גורמי ארס כדי לעורר את ההפנמה שלה לתאי אאוקריוטה ולשרוד בתוך תאים תת-תאיים שונים. מאמר זה מתאר בדיקת הגנה מפני אנזימים כדי לחקור את היקף הפנמת S. aureus ואת הישרדותה התאית בתאים פאגוציטיים לא מקצועיים דבקים (NPPCs) כמו גם את היעילות התאית של תרכובות מיקרוביאלית. NPPCs גדלים בצלחת רבת בארות עד שהם מגיעים למפגש של 100%. תרביות S. aureus גדלות בן לילה במדיום תרבית התאים. ההשעיה החיידקית מדוללת על פי מספר התאים לבאר כדי לחסן את התאים בריבוי מבוקר של זיהום. תאים מחוסנים הם דגירה במשך 2 שעות כדי לאפשר את החיידקים להיות מופנמים על ידי NPPCs, ואחריו ליסוסטאפין מתווסף למדיום התרבות להרוג באופן סלקטיבי חיידקים חוץ תאיים. ליוסוסטאפין נוכח במדיום התרבותי להמשך הניסוי.

בשלב זה, התאים הנגועים יכולים להיות דגירה עם תרכובות מיקרוביאלית כדי להעריך את הפעילות התארית שלהם נגד S. aureus. לאחר מכן, התאים נשטפים שלוש פעמים כדי להסיר את התרופות, ועומס S. aureus תאיים הוא כימת לאחר מכן על ידי culturing על לוחות אגר. לחלופין, לחקר גורמי וירפות staphylococcal המעורבים בהישרדות תאית ורעילות תאים, ליסוסטיפין יכול להיות מומת עם proteinase K כדי לחסל את הצורך בצעדי כביסה. טיפ זה משפר את האמינות של כימות עומס חיידקי תאי, במיוחד אם תאים נוטים להתנתק מצלחת התרבות כאשר הם נדבקים בכבדות בגלל הכפל של S. aureus תאי. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש עם כמעט כל סוגי NPPCs דבק ועם מודלים תרבית תאים 3D כגון organoids.

Introduction

סטפילוקוקוס אאורוס הוא גם פתוגן מסכן חיים וגם חיידק קומנסלי של העור ושל הרירית שמיישבת שני מיליארד אנשים ברחבי העולם1. אצל בני אדם, נשאי האף של S. aureus יש סיכון מוגבר של זיהום עם זן שלהם של הובלה; עם זאת, הגורמים הרב-גורמיים של קרון האירוס עדיין אינם ברורים 1,2. בנוסף לזיהומים חריפים, חולים יכולים גם לפתח זיהומים כרוניים S. aureus כי הם לעתים קרובות מאתגר לרפא3. הבנה טובה יותר של אינטראקציות מארח-פתוגן במהלך קולוניזציה וזיהום חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות ולשיפור ניהול המטופלים.

במבחנה, S. aureus יכול להפעיל את ההפנמה שלה לתוך תאים מארחים מבטא את α5β1 integrin4. האינטראקציה המשולשת בין חלבונים מחייבי פיברונקטין סטפילוקוק המעוגנים לקיר התא של S. aureus, הפיברונקטין והאינטגרין β1 המתבטאים במשטח התא המארח ידועה כמסלול הראשי של הפנמת S. aureus ב- NPPCs כגון קרטינוציטים, נסטיאובלסטים, פיברובלסטים ותאי אפיתל ואנדותל4. מחקרים אחרונים מראים כי S. aureus ניתן למצוא בתוך תאים אנושיים במהלך קולוניזציה האף5,6 וזיהום7. עם זאת, תפקידו של המאגר התאי בפתוגנזה של זיהום S. aureus עדיין לא ברור. התאים המארחים יכולים לשמש מקלט עבור S. aureus, אשר מוגן מפני המערכת החיסונית8 ואת רוב תרכובות מיקרוביאלית6,9.

בדיקת ההגנה על ליסוסטיפין, שתוארה על ידי Proctor10 מוקדם יותר בשנות השמונים, מאפשרת לחקור גורמים חיידקיים ומארחים המעורבים בהפנמה של מבודדי S. aureus. ליסוסטיפין הוא בקטריוצין המיוצר על ידי סימולנס סטפילוקוקוס, אשר מציג פעילות חזקה נגד כמעט כל מבודד S. aureus, כולל זנים עמידים לאנטיביוטיקה11. Lysostaphin שימש להרוס רק S. aureus חוץ תאי כדי לאפשר את הספירה של חיידקים תאיים קיימא בלבד12. טכניקה זו הייתה בשימוש נרחב ותרמה לגילוי של מספר גורמי ארס של S. aureus. גנטאמיצין, לבד בשילוב עם ליסוסטאפין, נמצא גם בשימוש נרחב לחקר חיידקים תאיים.

עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי גנטאמיצין נכנס לתאים אאוקריוטים ומגיע לחיידקים מופנמים באופן תלוי זמן וריכוז13. מחקר זה גם הראה כי ליזוזטפין אינו נכנס לתאים אאוקריוטים, המאשר כי הגנה על אנזימים מבוססי ליזוזטפין (EPA) היא הבחינה המדויקת ביותר לכימות עומס S. aureus תאי על ידי תרבות13. לא משנה איזו תרכובת משמשת להשמדת חיידקים חוץ תאיים (למשל, ליזוזטפין או גנטמיצין), יש להסיר אותה על ידי שטיפת התאים לפני ציפוי S. aureus תאי על לוחות אגר. שטיפות רצופות עלולות לגרום לניתוק תאים, במיוחד תאים דבקים בצורה גרועה (למשל, תאים נגועים בכבדות), מה שיוביל להערכת הערך של עומס S. aureus התאי. מאמר זה מתאר בפירוט כיצד ניתן להשתמש ב- EPA כדי לכמת את עומס ה- S. aureus התאי ולמדוד את היעילות התאית של תרכובות מיקרוביאלים באמצעות מודל במבחנה . ראוי לציין, שיטה פשוטה הוצעה כדי לשפר את האמינות של כימות עומס תאי על ידי הימנעות שטיפות אינטנסיביות.

Protocol

1. תרבות תאי האפיתל האנושיים

  1. הכן מדיום תרבית מלא עם גלוקוז גבוה בגודל נשר (DMEM) של Dulbecco עם אדום פנול, בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) ללא אנטיביוטיקה.
  2. לגדל A549 תאי אפיתל במדיום תרבית מלאה ב 36 ± 1 °C ב 5% CO2. ודא את השימוש בכלי תרבות בגודל מתאים כדי שיהיו מספיק תאים לשלבים הבאים (ראה שלב 1.10).
    הערה: בקבוקון אחד בגודל 75 ס"מ2 (T-75) מספיק כדי לזרוע שתי צלחות של 24 בארות ולתת-תרבות התאים.
  3. יומיים לפני ההדבקה, הכינו צלחת אחת של 24 בארות.
  4. הסר והשלך את מדיום התרבות שהוצא מבקבוק T-75 ולשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco ′(DPBS).
  5. הוסף 5 מ"ל של טריפסין-EDTA ודגרה את התאים במשך 5 דקות ב 36 ± 1 °C ב 5% CO2.
  6. הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבות מלאה ולהעביר את התאים לתוך צינור.
  7. צנטריפוגות התאים במשך 5 דקות ב 300 × גרם.
  8. להשליך את supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ"ל של מדיום תרבות מלאה טרי.
  9. ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (או תא ספירה).
  10. לדלל את התאים במדיום תרבית מלאה כדי להכין 30 מ"ל של השעיית תאים בריכוז של 2.0 × 105 תאים / מ"ל.
  11. הוסף 1 מ"ל של מתלה התא לכל באר של צלחת 24-well, אשר מתאים צפיפות תא של כ 1.0 × 105 תא / ס"מ עבור שטח באר של 2 ס"מ רבוע.
  12. לדגור על התאים במשך 48 שעות ב 36 ± 1 °C ב 5% CO2 עד שהם מגיעים 100% מפגש.
    הערה: בנוסף לתנאים שיש לבדוק, יש לשמור שלוש בארות לספירת תאים ביום ההדבקה (ראה שלב 3.1.4). על פי מספר התנאים שיש לבדוק, ניתן להכין עד שתי צלחות של 24 בארות בו זמנית. אמצעי אחסון המצוינים בפרוטוקול יש להגדיל בהתאם.

2. תרבות זני ס. אוריוס

  1. יומיים לפני ההדבקה, להכין זיהום מלא בינוני עם DMEM גלוקוז גבוה ללא פנול אדום, בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה.
  2. זני הפשרת S. aureus לבדיקה על לוחות אגר.
  3. לדגור על לוחות אגר במשך 18-24 שעות ב 36 ± 1 °C (70 °F).
  4. יום לפני החיסון, לחסן מושבה אחת של זן S. aureus להיבדק 10 מ"ל של מדיום זיהום מלא.
  5. לדגור את החיידקים במשך 18-24 שעות ב 36 ± 1 °C (50 °F) עם רועד ב 160 סל"ד. השתמש 50 mL צינורות מוחזקים ב 45° כדי למנוע את החיידקים להתיישב.
    הערה: לפני שמתחילים עם זן חדש, מומלץ לאמת את הרגישות של ליסוסטיפין באותם תנאים של תרבות שישמשו לניסויים נוספים (מדיה, עומסי חיידקים, וזמן ריכוז ודגירה של ליסוסטיפין). חשוב גם לקבוע את עומס החיידקים המתאים OD600nm של 0.5 כי זה יכול להשתנות מעט מזן אחד למשנהו. ניתן להתאים את תנאי התרבות של זני חיידקים על פי המטרה הניסיונית.

3. זיהום עם S. aureus

  1. קביעת צפיפות התאים וההיתכות
    1. הסר והשלך את מדיום התרבות שהוצא משלושת בארות ייעודיות לספירת תאי A549.
    2. הוסף 1 מ"ל של זיהום מלא בינוני המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל של Hoechst 33342 ו 1 מיקרוגרם / מ"ל של יוד פרופידיום.
      הערה: Hoechst 33342 הוא מוטגן ידוע ויש לטפל בו בזהירות. פרופיליום יודיד, מוטגן פוטנציאלי, חייב להיות מטופל בזהירות ולהיפטר בבטחה על פי התקנות החלות.
    3. לדגור על התאים במשך 30 דקות ב 36 ± 1 °C ב 5% CO2.
    4. ספר את מספר התא וחשב את הכדאיות של התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטיות של שדה אריסת.
      הערה: אם מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו זמין, ניתן לחשב את צפיפות התא ואת הכדאיות עם כתמים כחולים טריפן באמצעות תא ספירת תאים.
  2. הכנת ההשעיה החיידקית
    1. יש לפזר 25 מ"ל של זיהום מלא בינוני בצינור ולחמם מראש ב-36 ± 1 מעלות צלזיוס.
    2. התאם את השעיית S. aureus ל- anOD600nm של 0.5 במדיום זיהום מלא באמצעות מד צפיפות תאים.
    3. הכן 20 מ"ל של השעיה חיידקית לחיסון תאים על ידי דילול 0.5 OD600nm במדיום זיהום מלא כדי להשיג ריבוי של זיהום (MOI) של 1 על פי מספר התאים לבאר.
      הערה: ה- MOI תואם למספר החיידקים שנוספו לכל תא בכל באר. לדוגמה, כדי להשיג MOI של 1 עם 1.0 × 106 תאים לבאר, להכין השעיה חיידקית ב 2.0 × 106 CFU / mL, כך 106 CFU ניתן להוסיף בנפח של 500 μL (ראה שלב 3.3.3). ניתן להתאים את ה- MOI בהתאם לסוגי התאים וזני החיידקים שיש לבדוק.
    4. השתמש בצלחת ספירלה אוטומטית כדי לקבוע את עומס S. aureus של ההשעיה החיידקית מדוללת לשמש לשלב חיסון התא.
    5. לדגור על לוחות אגר במשך 18-24 שעות ב 36 ± 1 °C (70 °F).
    6. למחרת, לספור את מספר המושבות עם מונה מושבה כדי לחשב את MOI המדויק עבור כל זן נבדק.
      הערה: אם אין לוחית ספירלה אוטומטית זמינה, העומס החיידקי יכול להיקבע על ידי דילול סדרתי על צלחת אגר. עיין במדריך האנליטי הבקטריולוגי לפרטים14.
  3. חיסון תאים
    1. שים לב לכל באר של צלחת 24-well על ידי מיקרוסקופיה הגדלה נמוכה כדי להבטיח כי התאים בריאים וגדלים כצפוי.
    2. הסר והשלך את המדיום של תרבית התא שהוצאה מהצלחת 24-well.
    3. הוסף 500 μL של השעיית חיידקים עבור חיסון לכל באר עם 100% תאים משוחחים.
    4. לדגור על התאים במשך 2 שעות ב 36 ± 1 °C (5% CO2).
      הערה: מומלץ להשתמש בשלוש בארות של הצלחת עבור כל תנאי להיבדק (משולש) ולבצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. ניתן להתאים את עיכוב הדגירה בהתאם למטרה הניסיונית.
  4. כימות של חיידקים תאיים עם בדיקת הגנה משופרת מפני אנזימים (iEPA)
    1. הכן 7 מ"ל של 4x חיץ תמה עם 3.5 מ"ל של 2% טריטון X-100 במים סטריליים ו 3.5 מ"ל של טריפסין-EDTA.
    2. הכן פתרון מלאי ליסוסטיפין ב 10 מ"ג / מ"ל במאגר אצטט aliquot 25 μL לתוך cryovials. יש לאחסן ב-80 °C (70 °F) עד 6 חודשים.
    3. הכן 250 μL של פתרון עבודה ליסוסטיפין טרי ב 1 מ"ג / מ"ל על ידי ערבוב 25 μL של פתרון מלאי ליסוסטאפין (10 מ"ג / מ"ל) ו 225 μL של 0.1 M Tris-HCl. יש לאחסן ב-4 °C (7%), עד 48 שעות.
    4. הכן 6.25 מ"ל של זיהום מלא בינוני בתוספת ליזוזטפין על ידי הוספת 6 מ"ל של זיהום מלא בינוני ל 250 μL של פתרון העבודה ליזוזטפין.
    5. מוסיפים 250 μL של מדיום זיהום מלא בתוספת ליזוזטפין לתוך כל באר בעדינות להתסיס את הצלחת על ידי מערבולת את הצלחת ביד.
    6. לדגור את התאים במשך 1 שעות ב 36 ± 1 °C ב 5% CO2 כדי לתת ליסוסטיפין להרוג את החיידקים החוץ תאיים.
    7. בסוף זמן הדגירה, להוסיף 10 μL של proteinase K ב 20 מ"ג / מ"ל לתוך כל באר כדי לנטרל את lysostaphin.
    8. לדגור על התאים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. הוסף 250 μL של 4x מאגר תמה כדי לייס את התאים על ידי הלם אוסמוטי.
    10. לדגור על התאים במשך 10 דקות ב 36 ± 1 °C (50 °F).
    11. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה עשר פעמים בכל תחתית הבאר כדי להבטיח שהתאים יתכופפו והומוגניים לחלוטין.
    12. השתמש בצלחת ספירלה אוטומטית כדי לקבוע את עומס S. aureus של כל באר.
    13. לדגור על לוחות אגר במשך 18-24 שעות ב 36 ± 1 °C (70 °F).
    14. למחרת, לספור את מספר המושבות עם מונה מושבה כדי לחשב את עומס S. aureus תאי של כל באר.
  5. מדידת יעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית עם הגנה על אנזימים (EPA)
    1. הכן 25 מ"ל של חיץ תמיסת 1x עם 3.125 מ"ל של 2% טריטון X-100 במים סטריליים, 6.25 מ"ל של טריפסין-EDTA, ו 15.625 מ"ל של מים סטריליים.
    2. הכן 250 μL של פתרון עבודה ליסוסטיפין טרי ב 1 מ"ג / מ"ל על ידי ערבוב 25 μL של פתרון מלאי ליסוסטאפין (10 מ"ג / מ"ל) ו 225 μL של 0.1 M Tris-HCl.
    3. הכן 25 מ"ל של זיהום מלא בינוני בתוספת ליזוזטפין על ידי הוספת 24.75 מ"ל של זיהום מלא בינוני ל 250 μL של פתרון העבודה ליזוזטפין.
    4. עבור כל תרכובת מיקרוביאלית להיבדק, להכין 3.1 מ"ל של זיהום מלא בינוני בתוספת ליזוזטפין ואת המתחם מיקרוביאלית בריכוז להיחקר.
    5. הסר והשלך את המדיום של תרבית התא שהוצאה מהצלחת 24-well.
    6. הוסף 1 מ"ל של זיהום מלא בינוני בתוספת ליזוזטפין.
    7. לדגור את התאים במשך 1 שעות ב 36 ± 1 °C ב 5% CO2 כדי לתת ליסוסטיפין להרוג את החיידקים החוץ תאיים.
    8. הסר ולהשליך את המדיום בתוספת ליזוזטפין מן צלחת 24-well.
    9. מלא שלוש בארות עם 1 מ"ל של בינוני בתוספת ליזוזטפין בתוספת תרכובת מיקרוביאלית להיבדק.
    10. חזור על שלב 3.5.9 לבדיקת כל תרכובת מיקרוביאלית.
    11. עבור מצב הבקרה, למלא שלוש בארות עם 1 מ"ל של בינוני בתוספת ליזוזטפין ללא כל תרכובת מיקרוביאלית.
    12. לדגור את התאים במשך 24 שעות ב 36 ± 1 °C ב 5% CO2.
    13. בסוף תקופת הדגירה, להסיר ולהשליך את בינוני בילה בעדינות לשטוף כל באר שלוש פעמים עם DPBS סטרילי עם CaCl2 ו MgCl2.
    14. הוסף 1 מ"ל של 1x מאגר תמה לכל באר כדי לנתק ולפרוס את התאים על ידי הלם אוסמוטי.
    15. לדגור על התאים במשך 10 דקות ב 36 ± 1 °C (50 °F).
    16. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה עשר פעמים בכל רחבי הבאר כדי להבטיח כי התאים הם lysed מלא הומוגני.
    17. השתמש בצלחת ספירלה אוטומטית כדי לקבוע את עומס S. aureus של כל באר.
    18. לדגור על לוחות אגר במשך 18-24 שעות ב 36 ± 1 °C (70 °F).
    19. למחרת, לספור את מספר המושבות עם מונה מושבה כדי לחשב את עומס S. aureus תאי של כל באר.
      הערה: הפעילות התאית של כל תרכובת מיקרוביאלית צריכה להיות מחושבת על פי העומס החיידקי של מצב הבקרה. חשוב גם לבדוק את הציטוטוקסיות של כל התרכובות האנטי מיקרוביאלית כדי להוכיח כי ההבדלים שנצפו בין הבקרה לבין התרכובות אינם נובעים ממוות תאים.

Representative Results

התוצאות של הפנמת S. aureus על ידי תאי אפיתל A549 מתוארות באיור 1A. תאי A549 חוסנו עם S. aureus SF8300 WT ו- SF8300 ΔfnbA/B, שחסרים חלבונים מחייבי פיברונקטין A ו- B, ב- MOI של 1 ל -2 שעות. כדי להשמיד את ה-S. aureus החוץ-תאי, ליסוסטיפין התווסף למדיום התרבותי, והתאים דוגרו במשך שעה אחת. לאחר מכן, ליסוסטיפין הוסר על ידי כביסה עבור המשרד לאיכות הסביבה או מומת עם חלבון K עבור iEPA. לאחר מכן, התאים שובשו במאגר תמוגה, והעומס החיידקי היה מכמת על ידי תרבית. באמצעות המשרד לאיכות הסביבה, העומסים התאיים הממוצעים היו 4.46 ו- 0.49 יומן CFU / מ"ל עבור SF8300 WT ו- SF8300 ΔfnbA / B, בהתאמה (איור 1A, פסים ירוקים). באמצעות iEPA, המטענים התאיים הממוצעים היו 4.53 ו 0.56 יומן CFU / mL עבור SF8300 WT ו- SF8300 ΔfnbA / B, בהתאמה (איור 1A, פסים אדומים). מעניין לציין כי הן EPA והן iEPA הראו תוצאות דומות, אשר ניתן להסביר על ידי הקלות של ביצוע השטיפות כאשר התאים במצב טוב ובגלל הציטוטוקסיות הנגרמת על ידי S. aureus נמוכה מאוד בהגדרות ניסיוניות אלה (נתונים לא מוצגים).

התוצאות של פעילות תאית של ונקומיצין, ריפאמפיצין, levofloxacin נגד S. aureus מתוארים איור 1B. כדי למדוד את הפעילות התאית של אנטיביוטיקה אלה, תאי HaCaT חוסנו עם S. aureus ATCC 29213 ב MOI של 1 עבור 2 שעות. התאים היו דגירה עם ליסוסטאפין, עם או בלי תרכובות מיקרוביאלית להיבדק, במשך 24 שעות. לאחר מכן, ליסוסטיפין והתרכובות האנטי מיקרוביאלית הוסרו על ידי כביסה. התאים שובשו במאגר תמוגה, והעומס החיידקי היה מכמת לפי התרבות. העומסים התאיים הממוצעים היו 4.57, 4.51, 3.03 ו-2.91 יומן CFU/mL לשליטה, ונקומיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל), ריפאמפיצין (7 מיקרוגרם/מ"ל) ולבופלוקסיצין (10 מיקרוגרם/מ"ל), בהתאמה (איור 1B).

Figure 1
איור 1: עומס Staphylococcus aureus תאי בתאי אפיתל. (A) הגנה מפני אנזימים (ברים ירוקים) ובדיקת הגנה משופרת מפני אנזימים (סורגים אדומים) בתאי A549 הנגועים ב - S. aureus SF8300 WT ו- ΔfnbA/B. (B) פעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית בתאי ה- HaCaT הנגועים ב - S. aureus ATCC 29213. פסים מייצגים את הערכים הממוצעים של שלושה ניסויים עצמאיים המבוצעים בשלושה טריפלים. קווי שגיאה מייצגים את סטיות התקן. p < 0.0001. קיצורים: Ctrl = control; cfu = יחידות יוצרות מושבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ההסתה המתוארת כאן היא בעלת ערך לחקר היקף ההפנמה וההישרדות התאית של S. aureus ב- NPPCs, כמו גם היעילות התארית של תרכובות מיקרוביאלית6,15,16. כמה צעדים בשני פרוטוקולי ההסתה יכולים להיות קריטיים. המצב הבריאותי וצפיפות התאים חייבים להיות מבוקרים באופן מושלם ועקביים בין ניסויים עצמאיים. Inoculum חיידקי חייב להיות מתוקנן בקפידה כדי לקבל MOI אמיתי קרוב MOI תיאורטי ממוקד. באופן כללי, יש להקפיד לא לנתק אף אחד מהתאים בזמן ההצינורה. השטיפות להסרת ליסוסטיפין ואנטיביוטיקה הם צעדים קריטיים ב- EPA. השימוש בחלבון K נמצא כדי לשפר את השלב הזה כאשר לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה (ראה להלן). ואחרון חביב, התאים צריכים להיות מנותקים לחלוטין בכל באר והומוגניים ביסודיות לאחר הדגירה עם מאגר תמוגה כדי לכמת באופן אמין את העומס התאי S. aureus.

במקרים מסוימים, ייתכן שתיתקל בבעיות ויש לבדוק תחילה מספר נקודות. במקרה של חוסר רבייה, יש לזכור כי S. aureus יכול ליצור גושים, מה שהופך את כימות על ידי ספיגה לא מדויקת. גוש החיידקים יכול להיות מוגבר על ידי צנטריפוגה וצעדי כביסה אם המדיום התרבותי הוא להיות מוחלף (למשל, לחיסול חלבון מופרש). יש להשתמש בהשעיית החיידקים במהירות מכיוון שחיידקים ממשיכים לגדול בטמפרטורת החדר. היעילות lysostaphin יכול לרדת בגלל תנאי אחסון שגויים, pH תת-אופטימלי לפעילות אנזימים במדיה התרבותית, שונות בפעילות אנזימטית בין אצוות וספקים, וחוסר רגישות lysostaphin של זנים מסוימים בתנאי גדילה ספציפיים. פנול אדום יכול להיות השפעה בקטריוסטרית קלה, במיוחד כאשר המדיום התרבותי הוא עני יחסית בחומרים מזינים לעומת מרקים טיפוסיים המשמשים לגידול חיידקים. לכן, מומלץ להשתמש במדיום תרבית תאים ללא אדום פנול, אשר גם משפר תצפיות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות על ידי הפחתת רעשי הרקע.

למרות שיטה זו היא כלי רב ערך כדי ללמוד את הגורל התאי של זנים שונים, כמה גבולות של השיטה יש לקחת בחשבון. השימוש ב- MOI גבוה מאוד יכול להעמיס על יכולת ההפנמה על ידי NPPCs ולאזן את ההבדלים בין הזנים השונים שנבדקו. ניתן להמעיט בהיקף ההפנמה של הזנים הציטוטוקסיים ביותר מכיוון שליסוסטיפין (או אנטיביוטיקה) הורס במהירות את S. aureus המשתחרר על ידי תאים פגומים. לכן, ניסויים עם משכי זמן ממושכים (כלומר, כדי לחקור הישרדות תאית או פעילות תאית של אנטיביוטיקה) קל יותר להגדיר עם זנים עם ציטוקסיות נמוכה. לכן, זמן הדגירה ואת MOI צריך להיות מותאם במדויק על פי הלחץ, סוג התא, ואת המטרה הניסיונית.

השיטה המתוארת כאן עם השימוש lysostaphin הוא אמין יותר מאשר אלה המבוססים על גנטמיצין כי, שלא כמו lysostaphin, גנטמיצין נוטה להיות מופנמת על ידי תאים מארחים13. היתרון השני הוא האפשרות לנטרל את הליסוסטאפין. עיכוב של פעילות ליסוסטיפין דווח על ידי קים et al.13 עם השימוש EDTA כדי כלאט יונים אבץ או 1,10-phenanthroline; עם זאת, שטיפות אינטנסיביות עדיין נדרשות להסיר את האנזים לפני ציפוי של החיידקים. כאן, פרוטנאז K מאפשרת אי-הפעלה מהירה של ליסוסטאפין. ראינו כי תאים נוטים להתנתק מצלחת התרבות כאשר הם נדבקים בכבדות בגלל הכפל של S. aureus תאי. על ידי דילוג על שלב הכביסה הסופי, שיטת iEPA פישטה מאוד את הטיפול הטכני ואפשרה את התאוששות החיידקים המופנמים בתאים דבוקים או מנותקים כבר.

ריאגנטים ומאגרים מרוכזים יותר המשמשים ב- iEPA גם עזרו להפחית את מאמץ ההצינורות ולמזער את אובדן התאים. בנוסף, iEPA יכול לשמש עם תאים בהשעיה, כמו גם עם organoids שקשה לשטוף. לסיכום, בדיקות הגנה מפני אנזימים מאפשרות לחקור את מידת ההפנמה ואת גורלו התאי של S. aureus, כמו גם את הפעילות התאית של תרופות מיקרוביאלים עם מודלים במבחנה שונים. שיפורים צריכים להתבצע כדי לאפיין טוב יותר את הקשר בין הפנמה וציטוטוקסיות כדי להעריך טוב יותר את החשיבות של פיתוח תרופות המסוגלות להגיע S. aureus בתוך התא.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

זני S. aureus SF8300 WT ו- SF8300 ΔfnbA/B הוענקו בנדיבות על ידי פרופ ' בין דיפ (אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו, ארה"ב). עבודה זו נתמכה על ידי מענק של עמותת FINOVI (#AO13 FINOVI) בחסות הקרן לאוניברסיטת ליון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת <em>Staphylococcus aureus</em> ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter