בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

סיכום

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

תקציר

דג הזברה יוצר שני מבני כליות בחייו. הנוטה (כליה עוברית) נוצרת במהלך התפתחות עוברית ומתחילה לתפקד ביומיים לאחר ההפריה. המורכב משני נפרונים בלבד, הנוטה משמשת ככליה היחידה במהלך חיי הזחל עד שנדרשת תפקוד כליות נוסף בשל מסת הגוף ההולכת וגדלה. כדי להתמודד עם דרישה גבוהה זו, mesonephros (כליה בוגרת) מתחיל להיווצר במהלך מטמורפוזה. הנפרונים הראשיים החדשים מתמזגים לנוודים ויוצרים לומן מחובר. לאחר מכן, נפרונים משניים מתמזגים לראשונים (וכן הלאה) כדי ליצור רשת הסתעפות במסונפרוס. הרוב המכריע של המחקר מתמקד נוטה בשל הקלות של שימוש בעוברים. לכן, יש צורך לפתח טכניקות ללמוד זחלים מבוגרים וגדולים יותר ודגים צעירים כדי להבין טוב יותר את התפתחות mesonephros. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום לניתוח ביטוי גנים מותאם לחדירת בדיקה, שטיפת בדיקות ונוגדנים, והלבנת פיגמנטים כדי לדמיין טוב יותר את mesonephros. הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP) משמש לתיוג תאי אבות ואת הצינורות הדיסטליים של נפרונים המתהווים. פרוטוקול זה ממלא פער במחקר mesonephros. זהו מודל חיוני להבנת האופן שבו רקמות כליות חדשות נוצרות ומשתלבות עם נפרונים קיימים ומספקות תובנות על טיפולים רגנרטיביים.

מבוא

עובר דג הזברה הוא מודל חשוב לחקר התפתחות הרקמות בשל גודלו הקטן, השקיפות, הכלים הזמינים וההישרדות שלו ללא הזנה עד חמישה ^ימים1,2. היא תרמה רבות להבנת התפתחות הכליות ולשימור בין דגי זברה ליונקים3,4,5. הכליה ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס נוזלי, סינון הדם והפרשת ^פסולת6. הנפרון, היחידה התפקודית של הכליה, כולל מסנן דם המחובר לצינור ארוך. בדגי זברה נוצרים שני מבני כליות לאורך כל חייו. הנוטה (הכליה העוברית הזמנית) נוצרת תחילה במהלך ההתפתחות המוקדמת. הוא מורכב משני נפרונים רצים לאורך הציר הקדמי-....

פרוטוקול

השימוש בזחלי דגי זברה וצעירים מאושר על ידי IUP IACUC (פרוטוקול #02-1920, #08-1920). פרטי תוכן הפתרון מפורטים ברשימת החומרים.

1. גידול זחלים

הערה: זה ייקח עד 21 ימים או יותר כדי להעלות זחלים וצעירים לשלב של עניין.

1. הקימו דגי זברה בוגרים להזדווג על ידי הוספת דג זכר אחד ונקבה במיכל הזדווגות בשעות אחר הצהריים המאוחרות לאחר הארוחה האחרונה שלהם.
   הערה: לא כל זוגות הדגים יתזדווגו. התחל על ידי הגדרת 20 זוגות כדי לקבוע את קצב ההזדווגות ולהתאים בהתאם בניסויים עתידיים.
2. למחרת לאחר שהדגים סיימו להזדווג (בסביבות השעה 13:00), אוספים את העוברים עם בינוני E3 בצלחות פטרי.
   1. ודא כי אין יו....

תוצאות

באמצעות הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP), הוכח כי זה בפרוטוקול הכלאה במקום יעיל בתיוג תאי צאצא כליות ומבנים שונים של נפרון במהלך פיתוח mesonephros. כצפוי, מערכת העצבים המרכזית מסומנת גם בקו מהונדס זה (לא מוצג). הנפרון המסונפירי הראשוני נוצר במהירות של כ-5.2 מ"מ, גב לנטייה (איור 2A), והצינור הדיסטלי של הנפרון הזה מסומן על ידי ^EGFP10,12. אשכולות אבות קיימים בשלב זה ובהמשך (איור 2A-B

דיון

שיטת ההכלאה במקום המתוארת כאן נועדה ללמוד פיתוח מסונפרוס. עם זאת, ניתן ליישם אותו כדי לחקור את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים במהלך מטמורפוזה, כגון המעיים, מערכת העצבים, קשקשים, ^{פיגמנטציה14}. בדיקות ניתן ליצור עבור גנים אנדוגניים או סמנים פלואורסצנטיים בקווים מהונדסים.

זה קריטי עבור הזחלים להישאר שלם על מנת להתבונן באיברים וברקמות בהקשר הטבעי שלהם. כדי לשמור על שלמות הרקמה, חשוב למזער את זמן הטיפול בחלבון K. חשוב לקבוע את זמן הטיפול הטוב ביותר עבור כל אצווה חדש.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן אנטי פלואורסצאין	Roche/Sigma-Aldrich	11426338910
תמיסת			0.8% KOH, 0.9% H2O2
במגיב חוסם	Roche/Sigma-Aldrich	11096176001	שימוש לתמיסת חסימה, הכנה לפי הוראות היצרן
מסננת תאים	פישר סיינטיפיק	22-363-549	100 μ m
E3 בינוני			5 מ"מ NaCl, 0.33 מ"מ CaCl2, 0.33 מ"מ MgSO4, 0.17 מ"מ KCl, 0.0001% מתילן
כחול מניפולטור ריסים	פישר סיינטיפיק	NC1083208	שימוש למניפולציה של זחלים תמיסת
		קיבוע	4% פרפורמלדהיד, 1% DMSO ב-PBS; חום ב-65° C תוך כדי ניעור עד שהאבקה נמסה, ואז להוסיף DMSO לאחר שהיא מתקררת
סינתזת בדיקה פלואורסצאין	Roche/Sigma-Aldrich	11685619910
	Fisher Scientific	03-338B
אנקפסולציה של Hatchfry	Argent
Hyb- 50			% פורממיד, 5X SSC, 0.1% תמיסת
		Tween-20 Hyb+	HYB-, 5 מ"ג/מ"ל טורולה RNA, 50 ug/mL הפרין
MAB (10X)			1 M חומצה מאלית, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT			1X MAB, 0.1% Tween-20
חומצה מאלית	סיגמא-אולדריץ'	M0375
פרפורמלדהיד	סיגמא אולדריץ'	158127
PBS (10X)			8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST			1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2			1X PBS, 0.2% Tween-20
אבקת מזון			מערבבים 2 גרם מכל אחד מספירולינה ואנקפסולון ב-50 מ"ל מים של מערכת הדגים ומנערים היטב
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P5568	השתמש כדי לחלחל זחלים
תמיסת			Proteinase K20  μ גרם/מ"ל, ריכוז סופי של 1% DMSO
באבקת ספירולינה מיקרו-דקה	ארג'נט
SSC (20X)			3 M NaCl, 0.3 M נתרן אצטט נטול מים, pH 7, אוטוקלאב
SSCT (0.2X)			מדולל מ-20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X)			מדולל מ-20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer			100 מ"מ Tris pH 9.5, 50 מ"מ MgCl2, 100 מ"מ NaCl, 0.1%
תמיסת			200 μ גרם/מ"ל יודוניטרוטרזוליום כלוריד, 200 μ גרם/מ"ל 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate מלח דיסודיום, במאגר מכתים
תמיסת			1 מ"מ EDTA, pH 5.5, ב-PBST
Torula (שמרים) RNA	Sigma-Aldrich	R6625
Tricaine	Sigma Aldrich	E10521	2%, pH 7
מאגר			50% פורממיד, 2X SSC, 0.1% Tween-20

הלבנה PBST בקבוקון זכוכית תמיסת צביעה Tween-20 עצירה כביסה