ゼブラフィッシュは腎臓の発達を理解するための重要なモデルです。ここで、イン ・シチュハイブリ ダイゼーションプロトコルは、メサネフォロスの発生中にゼブラフィッシュ幼虫および若年者の遺伝子発現を検出するように最適化される。
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この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュは、その生涯で2つの腎臓構造を形成します。この発症(胚性腎臓)は、胚発生時に形成され、受精後2日で機能し始める。2つのニーフロンだけで構成され、体重増加のためにより多くの腎機能が必要になるまで、幼虫の生活の間に唯一の腎臓として機能する傾向があります。この高い需要に対処するために、メソネフロス(成人腎臓)は変態の間に形成し始める。新しい一次ニーフロンは、傾向のある咽頭に融合し、接続されたルーメンを形成する。次に、二次ニーフロンは一次のネフロンに融合し(など)メソネフロスに分岐ネットワークを作ります。研究の大半は、胚の使用の容易さのために、傾向に焦点を当てています。したがって、 メサネフォロスの開発をよりよく理解するために、古くて大きな幼虫と若年魚を研究する技術を開発する必要があります。.ここでは、遺伝子発現解析のための in in in 遺伝子発現促進プロトコルが、プローブの浸透、プローブおよび抗体の洗浄、およびメサネフロスをよりよく可視化するための顔料の漂白に最適化されている。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインは、前駆細胞および新生性ネフロンの遠位細管を標識するために使用されます。このプロトコルは、メサネフロス研究のギャップを埋めます。これは、新しい腎臓組織がどのように形成され、既存のニーフロンと統合し、再生療法に関する洞察を提供するかを理解するための重要なモデルです。
概要
ゼブラフィッシュ胚は、その小さなサイズ、透明性、利用可能なツール、および最大5日間の給餌なしで生存のために組織の発達を研究するための重要なモデルです1,2。これは、ゼブラフィッシュと哺乳類の間の腎臓の発達と保全の理解に大きく貢献してきました3,4,5.腎臓は、体液性恒常性を維持し、血液を濾過し、廃棄物を排泄する上で不可欠な役割を果たす6。腎臓の機能単位である腎は、長い細管に接続された血液フィルターを含む。ゼブラフィッシュでは、2つの腎臓構造がその生涯を通じて形成される。発症初期の初期の段階で最初に形成される傾向がある(一時的な胚性腎臓)。それは前部後軸に沿って走る2つの腎で構成され、受精後2日(dpf)の周りに機能する。この傾向の有用性は、その単純性にあり、ほとんど線形で視覚化しやすい2つのニーフロンを持っています(ただし、近位畳の尿細管は3 dpfでコイルし始めます)。これは中間中期からその初期の開発の研究を促進しただけでなく、セグメンテーションパターンおよび管状の修理7,8<....
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プロトコル
ゼブラフィッシュの幼虫と少年の使用は、IUP IACUC(プロトコル#02-1920、#08-1920)によって承認されています。ソリューションの内容の詳細は、 材料表にリストされています。
1. 幼虫を育てる
注:幼虫や少年を対象段階まで上げるには、最大21日以上かかります。
- 最後の食事の後、午後遅くに交配タンクに1匹のオスと1匹のメスの魚を加えて、成虫のゼブラフィッシュを合分するように設定します。
注:すべての魚のペアが交尾するわけではありません。20組を設定して交配速度を決定し、今後の実験で調整します。 - 魚が交尾を終えた翌日(午後1時頃)、ペトリプレートにE3培地で胚を集めます。
- プレートあたり30個以下の胚を確認してください。
- ペトリプレートから破片(便などの)を取り除き、20mLのE3培地を加えます。
- 28.5 °Cで1日インキュベートします。
- 成虫のゼブラフィッシュを水生系に戻します。
- 1 dpf で、E3 メディアを新しい E3 に交換します。
- 28.5 °Cで5dpfまでさらに4日間インキュベートする。
- 400 μmのスクリーンを2.8 Lタ....
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結果
Tg(lhx1a-EGFP)トランスジェニックラインを用いて、このインサイチュハイブリダイゼーションプロトコルは、メサネフォロスの発生時に腎臓前駆細胞および種々のニーフロン構造を標識するのに有効であることを実証した。予想通り、中枢神経系もこのトランスジェニックライン(図示せず)で標識される。最初のメゾネフリック腎膜は約5.2mmで形成され、その後ろは、起こりやすい(図2A)、およびこの腎管の遠位管はEGFP10,12によって標識される。前駆星クラスタは、この段階以降(図2A-B、矢印の頭)に存在し、単一の前駆細胞も標識されています(図2C)。この方法は、腎臓の発達を研究する追加のツールを提供し、人間の腎臓を理解する光を当てるのに役立ちます。<.......
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ディスカッション
ここで説明する in situ ハイブリダイゼーション法は、メソネフォロスの開発を研究することを目的としています。しかし、腸、神経系、スケール、色素沈着などの変態中の他の組織や臓器の発達を研究するために適用することができます。プローブは、トランスジェニックラインの内因性遺伝子または蛍光マーカーに対して生成され得る。
幼虫は、本来の文脈で臓器や組織を観察するためにそのまま残ることは重要です。組織の完全性を保つためには、プロテアーゼK治療の時間を最小限に抑えることが重要です。酵素の新しいバッチごとに最良の処理時間を決定することが重要です。あるいは、アセトンは、組織完全性を改善するためにプロテナーゼKの代わりに使用することができる16。過度の漂白はまた、組織の完全性を低下させます。最小限の漂白と目がいくつかの色素沈着を保持できるようにすることは、手術中に幼虫を視覚化するのに役立ちます。組織の脆弱性の指標であるハイブリダイゼーションステップ中に目が落ちることは一般的です。DMS.......
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
資金は、ペンシルベニア科学アカデミー、ペンシルベニア州生物学者の連邦、ペンシルベニア大学(大学院研究研究部、生物学部、シンシア・サシャク学部優秀生物学基金)によって提供されました。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインは、ニール・フクリード博士(ピッツバーグ大学)によって提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗フルオレセイン抗体 | ロシュ/シグマ-アルドリッチ | 11426338910 | |
| 漂白液 | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| ブロッキング試薬 | ロシュ/シグマ-アルドリッチ | 11096176001 | ブロッキング溶液に使用し、製造の指示に従って調製します |
| セルストレーナー | フィッシャーサイエンティフィ | 22-363-549 | 100 &MU;m |
| E3 中 | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% メチレンブルー | ||
| まつげマニピュレーター | フィッシャーサイエンティフィック | NC1083208 | 幼虫の操作に使用 |
| 固定液 | 4% パラホルムアルデヒド, 1% DMSO in PBS; 65°C;C粉末が溶解するまで振とうし、冷やした後にDMSOを添加 | ||
| フルオレセインプローブ合成 | ロシュ/シグマ-アルドリッチ | 11685619910ガラス | |
| バイアル | ッシャーサイエンティフィック | 03-338B | |
| ハッチフライカプセル化 | アージェント | ||
| Hyb-溶液 | 50%ホルムアミド、5X SSC、0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+溶液 | HYB-、5 mg/mL トルラ RNA、50 ug/mL ヘパリン | ||
| MAB (10X) | 1 M マレイン酸、1.5 M NaCl、pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB、0.1% Tween-20 | ||
| マレイン酸 | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl、0.2% KCl、1.44% Na2HPO4、0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| 粉末食品 | スピルリナとハッチフライのカプセル化をそれぞれ2gずつ50mLの魚類システムに混ぜ、よく振る | ||
| プロテイナーゼK | Sigma-Aldrich | P5568 | 幼虫の透過処理に使用 |
| プロテイナーゼK溶液 | 20 μg/mL、PBST | ||
| スピルリナ微粉末 | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl、0.3 M 無水酢酸ナトリウム、pH 7、オートクレーブ | ||
| SSCT (0.2X) | 20X SSC から希釈、0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | 20X SSC、0.1% Tween-20 | ||
| 染色バッファー | から希釈100 mM Tris pH 9.5、50 mM MgCl2、100 mM NaCl、0.1% Tween-20 | ||
| 染色液 | 200 μg/mL ヨードニトロテトラゾリウム塩化物、200 μg/mL 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸二ナトリウム塩、染色緩衝液 | ||
| 中 停止溶液 | 1 mM EDTA、pH 5.5、PBST | ||
| トルラ(酵母)RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%、pH 7 |
| 洗浄緩衝液 | 50% ホルムアミド、2X SSC、0.1% Tween-20 |
参考文献
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).<....
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