תרומה זו מתארת כיצד להגדיר התגבשות חלבונים בהתקני גביש על גביש וכיצד לבצע איסוף נתונים סדרתי אוטומטי בטמפרטורת החדר באמצעות פלטפורמת ההתגבשות על השבב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התגבשות על השבב ודיפרקציה טורית בקנה מידה גדול בטמפרטורת החדר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניתן להבין בצורה הטובה ביותר תגובות ביוכימיות ותהליכים ביולוגיים על ידי הדגמת האופן שבו חלבונים עוברים בין מצבם התפקודי. מאחר שטמפרטורות קריוגניות אינן פיזיולוגיות ועשויות למנוע, להרתיע או אפילו לשנות את הדינמיקה המבנית של חלבונים, שיטה חזקה לניסויים שגרתיים של עקיפת קרני רנטגן בטמפרטורת החדר רצויה מאוד. התקן הגביש על הגביש והחומרה והתוכנה הנלוות לו המשמשות בפרוטוקול זה נועדו לאפשר עקיפת קרני רנטגן באתרה בטמפרטורת החדר עבור גבישי חלבון בגדלים שונים ללא כל מניפולציה של דגימה. כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור השלבים העיקריים מהרכבת המכשיר, התגבשות על השבב, סריקה אופטית, זיהוי גבישים ועד תכנון צילומי רנטגן ואיסוף נתונים אוטומטי. מכיוון שפלטפורמה זו אינה דורשת קצירת גבישים או כל מניפולציה אחרת של דגימות, ניתן להכניס מאות עד אלפי גבישי חלבון הגדלים על שבב לקרן רנטגן באופן הניתן לתכנות ובתפוקה גבוהה.
מבוא
בשל ההשפעות המייננות של קרינת רנטגן, קריסטלוגרפיה של חלבונים, במידה רבה, הוגבלה לתנאים קריוגניים בשלושת העשורים האחרונים. לכן, הידע הנוכחי על תנועות חלבונים במהלך תפקודו נובע במידה רבה מהשוואות בין מבנים סטטיים שנצפו במצבים שונים בתנאים קריוגניים. עם זאת, טמפרטורות קריוגניות מעכבות בהכרח את התקדמות התגובה הביוכימית או את ההמרה בין מצבי קונפורמציה שונים בזמן שמולקולות חלבון פועלות. כדי לצפות ישירות בדינמיקה המבנית של חלבונים ברזולוציה אטומית על ידי קריסטלוגרפיה, יש צורך בשיטות חזקות ושגרתיות לביצוע ניסויי עקיפה בטמפרטורת החדר, מה שמחייב חידושים טכניים במסירת דגימות, איסוף נתונים וניתוח נתונים אחוריים. לשם כך, ההתקדמות האחרונה בקריסטלוגרפיה סדרתית הציעה דרכים חדשות ללכי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הרכבה מראש של המכשיר
- סמן את הטבעת החיצונית (קוטר 30 מ"מ) לזיהוי דגימה. במידת הצורך, כלול את שם הפרויקט, מספר ההתקן, מצב ההתגבשות והתאריך (איור 1A). הניחו את הטבעת החיצונית במהופך על משטח נקי (איור 1B), והניחו בזהירות פרוסת קוורץ אחת בתוך הטבעת (איור 1C). פרוסת קוורץ ראשונה זו משמשת כחלון כניסה לצילומי הרנטגן של האירוע.
- מוזגים כמות קטנה של שמן טבילה במיקרוסקופ (צמיגות של 150 cSt) לתוך צלחת פטרי. טבלו שים בשמן, וודאו ששני צידי השים משומנים כראוי (איור 1D). הסירו את עודפי השמן על ידי טפיחה של השן על משטח נקי. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מספר מערכי נתונים מייצגים פורסמו בשנים האחרונות 10,12 יחד עם התוצאות הקריסטלוגרפיות והממצאים המדעיים ממגוון רחב של דגימות חלבונים, כולל חלבונים ואנזימים פוטורצפטורים, לדוגמה, פוטורצפטור UV-B פוטורצפטור צמחי UVR8, תיקון DNA מונע אור פוטוליאז PhrB10, חלבון חישת אור אדום רחוק חדשני מהיסטידין קינאז חושי רב-תחומי 14 תחומי ליגנד/אור עם חיישן כפול, ומודול הליבה הפוטו-חושית של בקטריופיטוכרום12., כתוצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קריסטלוגרפיה של חלבונים בשנים הראשונות שבוצעה בטמפרטורת החדר חוותה קושי עצום במאבק בנזקי קרינת רנטגן. לפיכך, הוא הוחלף על ידי שיטת קריוקריסטלוגרפיה חזקה יותר כאשר מקורות רנטגן סינכרוטרון הפכו זמינים20. עם הופעתם של לייזרים נטולי אלקטרונים בקרני רנטגן, קריסטלוגרפיה של חלבונים בטמפרטורת החדר קמה לתחייה בשנים האחרונות, עם התפתחויות חדשות רבות המונעות על ידי הרצון לצפות בדינמיקה המבנית של חלבונים בטמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית 2,21. הפית.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ZR היא הממציאה של שבבי קריסטל-על-גביש על 9632042 הפטנט האמריקאי שהוענק לחברת Renz Research, Inc.
תודות
השימוש במקור פוטונים מתקדם, מתקן משתמש של משרד המדע שהופעל עבור משרד האנרגיה האמריקאי על ידי המעבדה הלאומית ארגון, נתמך על ידי חוזה DE-AC02-06CH11357. השימוש ב- BioCARS נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מענק מספר R24GM111072. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. השימוש ב- LS-CAT Sector 21 נתמך על ידי תאגיד הפיתוח הכלכלי של מישיגן ומענק המסדרון המשולש הטכנולוגי של מישיגן 085P1000817. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, המכונים הלאומיים לבריאות (R01EY024363) והקרן הלאומית למדע (MCB 2017274) ל- XY.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תוכנת ניתוח | שפותחה | ||
| Cerium מסומם איטריום אלומיניום נופך | MSE אספקה | CE: Y3Al5O12, YAG מצעי גביש יחיד | |
| מחזיק שבב | שפותח בבית | ||
| שמן טבילה | מעבדות Cargille | 16482 | סוג A נמוך צמיגות 150 cSt |
| פלטפורמת inSituX | שפותחה | ||
| אור IR | Thorlabs משולב | LED1085L | LED עם עדשת זכוכית, 1085 ננומטר, 5 mW, TO-18 |
| מיקרוסקופ | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| טבעת חיצונית | שפותחה | ||
| צלחת פטרי | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| פיפטה | פיפטמן | F167380 | P10 |
| משאבת לייזרים | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 ננומטר, 400 mW ואוסלאש; 9 מ"מ, קוד סיכה E, דיודת לייזר |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| טבעת שמירה | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 טבעת שמירה עבור Ø צינורות עדשה ותושבות 1 אינץ' |
| קריסטל קוורץ ללא זרעים | ופלים של אוניברסיטת בע"מ. | U01-W2-L-190514 | קוטר 25.4 מ"מ חיתוך Z עובי 0.05 מ"מ פוליש צד כפול 8 מ"מ על - |
| X Shim | פיתח | ||
| בבית עצירת קרן רנטגן | פותח |
מקורות
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).
- Schaffer, J. E., Kuks....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
