本方案介绍了如何结合数字滴定PCR（dd-PCR）、小规模AAV制备、玻璃体内注射、视网膜成像及视网膜基因组DNA提取，定量小鼠视网膜中AAV的转导效率。
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本文内容
摘要
摘要
目前，许多视网膜细胞生物学实验室已常规使用腺相关病毒（AAV）进行基因编辑和调控应用。AAV转导效率通常至关重要，直接影响整体实验结果。决定转导效率的主要因素之一是AAV载体的血清型或变体。目前已有多种人工构建的AAV血清型和变体，它们对宿主细胞表面受体具有不同的亲和力。在视网膜基因治疗中，这导致不同视网膜细胞类型的转导效率存在差异。此外，注射途径以及AAV制备的质量也可能影响视网膜中AAV的转导效率。因此，比较不同变体、批次和方法的转导效率十分必要。数字滴定PCR（dd-PCR）方法能够高精度地定量核酸，且无需标准品或参照物即可实现对特定目标的绝对定量。利用dd-PCR，还可通过绝对定量注射后视网膜内AAV基因组拷贝数来评估AAV的转导效率。本文提供了一种利用dd-PCR定量AAV在视网膜细胞中转导率的简便方法。经过少量修改后，该方法也可用于线粒体DNA拷贝数的定量，以及评估碱基编辑效率，这对于多种视网膜疾病及基因治疗应用具有重要意义。
引言
腺相关病毒（AAVs）目前已被广泛用于多种视网膜基因治疗研究。AAVs 提供了一种安全且高效的基因递送方式，具有较低的免疫原性和较少的基因组整合风险。AAV 进入靶细胞的过程通过内吞作用实现，该过程需要病毒与细胞表面的受体和共受体结合1,2。因此，AAV 对不同类型细胞的转导效率主要取决于其衣壳以及与宿主细胞受体的相互作用。AAV 具有不同的血清型，每种血清型可能表现出独特的细胞/组织嗜性及转导效率。此外，还可通过病毒衣壳的化学修饰、杂合衣壳的构建、肽段插入、衣壳重排、定向进化以及合理诱变等方法，人工构建 AAV 血清型和变异体3。即使衣壳的氨基酸序列或结构发生微小改变，也可能影响其与宿主细胞因子的相互作用，从而导致嗜性发生变化4。除了衣壳变异体外，注射途径以及 AAV 生产过程中的批次间差异等因素也会影响 AAV 在神经视网膜中的转导效率。因此，建立可靠的比较不同变异体转导效率的方法十分必要。
目前大多数测定腺相关病毒（AAV）转导效率的方法依赖于报告基因的表达，包括荧光成像、免疫组织化学、蛋白质印迹或对报告基因产物进行组织化学分析5,6....
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方案
所有实验方案均经萨班哲大学伦理委员会批准，并按照“视觉与眼科研究协会”关于实验动物使用的声明进行。
1. 小规模 AAV 制备12
- 使用15 cm培养板，在10 mL完全DMEM/10% FBS培养基中培养HEK293T细胞，直至细胞融合度达到70-80%。
- 在5 mL DMEM中制备转染混合物，其中包含20 µg辅助质粒（pHGT1-Adeno1）、7 µg衣壳质粒、7 µg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE载体以及136 µL PEI溶液（1 mg/mL）。
- 将5 mL制备好的转染混合物加入含有10 mL培养基的细胞培养皿中，将转染后的细胞在37 °C下孵育48-60小时。
- 在转染后48-60小时收集培养上清，加入DNase I至终浓度为250 U/mL，在37 °C下消化30分钟。
- 将消化后的上清在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，随后用0.22 µm针头滤器过滤，并收集至预先润湿的100 kDa再生纤维素膜中。
- 将再生纤维素膜在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，弃去滤过液。
- 用含0.001% Pluronic F-68的PBS洗涤再生纤维素膜，并在4000 × g
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结果
小规模AAV生产是一种快速高效的方法，可为玻璃体内注射提供载体（图1）。小规模AAV生产通常可获得约1 × 1012 GC/mL的滴度，足以在视网膜中检测到报告基因的表达（图2）。使用数字滴定PCR（dd-PCR）进行AAV滴度测定可获得一致的结果。常规使用ITR2和WPRE特异性引物，通过dd-PCR软件将目标分子的起始浓度建模为泊松分布进行计算。最终通过乘以稀释倍数并换算为每毫升基因组拷贝数（GC/mL）完成计算。本方案所制备的AAV2/BP2和AAV2/PHP.S的滴度分别为1.63 × 1012 GC/mL和1.7 × 1012 GC/mL7,15。作为对照，两种血清型使用了相同的tdTomato表达载体。我们注射了大致相等滴度的AAV，以量化AAV的转导效率。在注射上述浓度的AAV 1 µL后，分别于1周和2周时间点对动物进行成.......
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讨论
在本实验方案中，我们构建了两种具有不同衣壳蛋白的AAV载体，并分别对其进行了滴定。该方案最关键的步骤之一是生产出足够量的AAV，以确保转导后能够检测到报告基因的表达12,13。
AAV滴定也是调整玻璃体内注射AAV剂量的重要因素。一旦满足这些关键条件，即可采用数字滴定PCR（dd-PCR）方法对AAV的转导效率进行定量分析。
许多实验室正在使用定量PCR（qPCR）方法对AAV进行滴度测定。基于qPCR的绝对定量方法需要一条标准曲线，该曲线包含已知数量目标DNA的不同稀释浓度样品18。然而，数字滴定PCR（dd-PCR）无需标准曲线，因为它通过检测含有至少一个拷贝目标DNA的阳性液滴，直接定量给定样品中目标分子的总数。由于dd-PCR是一种终点分析，且不需要标准曲线，因此在qPCR反应中可能出现的效率问题（例如低效PCR或标准曲线质量不佳）在dd-PCR中影响较小.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢巴塞尔分子与临床眼科学研究所复杂病毒平台的Oezkan Keles、Josephine Jüttner和Botond Roska教授在AAV生产方面提供的帮助与支持。我们还感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jean Bennett教授提供AAV8/BP2菌株。动物实验在盖布泽技术大学动物实验中心进行，对此我们感谢Leyla Dikmetas和Uygar Halis Tazebay教授在技术协助和动物饲养方面提供的支持。我们还感谢Fatma Ozdemir博士对稿件提出的宝贵意见。本研究得到土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）项目（资助号：118C226 和 121N275）以及萨班哲大学整合项目基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔半裙边ddPCR板 | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon滤器 | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96深孔PCR仪 | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj小鼠品系 | Janvier | C57BL/6JRj | 小鼠 |
| DG8密封垫 | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8微流控芯片 | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM培养基 | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS缓冲液 | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS胎牛血清 | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| PX1 PCR板封膜机用铝箔封膜 | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| 胰岛素注射器 | BD Medical | 320933 | 玻璃体内注射 |
| 异氟烷 | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | 麻醉剂 |
| 微量注射器MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | 玻璃体内注射 |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | 基于3-CCD彩色相机、图像采集卡和现成软件的显微成像系统，可实现小鼠视网膜成像。 |
| 美多丽（2.5%盐酸去氧肾上腺素） | Alcon | S01FB01 | 瞳孔扩张 |
| Nanofil微量注射器 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | 玻璃体内注射 |
| 针头 RN G36，25 mm，PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | 玻璃体内注射 |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| 青霉素-链霉素双抗 | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| 质粒pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR板封膜系统 | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200微滴读取仪/QX200微滴生成仪 | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - 长度 = 13.5 cm | endostall medical | EJN-160-0155 | 视网膜分离 |
| 无菌注射器滤器 | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| 组织基因组DNA提取试剂盒 | EcoSpin | E1070 | 基因组DNA提取 |
| 托百士（0.3%妥布霉素 / 0.1%地塞米松） | Alcon | S01CA01 | 抗炎/抗生素 |
| 托吡卡胺（0.5%） | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | 瞳孔扩张 |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| 维速达（卡波姆 2 mg/g） | Bausch+Lomb | S01XA20 | 润滑型滴眼液 |
参考文献
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry.
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