Представлены методики измерения активности ключевых ферментов метаболизма гликогена с использованием простого спектрофотометра, работающего в видимом диапазоне.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Спектрофотометрические методы исследования метаболизма эукариотического гликогена
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гликоген синтезируется в качестве формы хранения глюкозы широким спектром организмов, начиная от бактерий и заканчивая животными. Молекула содержит линейные цепи α1,4-связанных остатков глюкозы с ветвями, вводимыми путем добавления α1,6-связей. Понимание того, как регулируется синтез и деградация гликогена и как гликоген достигает своей характерной разветвленной структуры, требует изучения ферментов хранения гликогена. Однако методы, наиболее часто используемые для изучения этих ферментных активностей, обычно используют реагенты или методы, которые доступны не всем исследователям. Здесь мы обсуждаем ряд процедур, которые технически просты, экономически эффективны и все же способны обеспечить ценную информацию о контроле хранения гликогена. Методы требуют доступа к спектрофотометру, работающему в диапазоне от 330 до 800 нм, и описаны при условии, что пользователи будут использовать одноразовые пластиковые кюветы. Тем не менее, процедуры легко масштабируются и могут быть изменены для использования в считывателе микропластин, что позволяет проводить высокопараллельный анализ.
Введение
Гликоген широко распространен в природе, причем соединение содержится в бактериях, многих протистах, грибах и животных. В микроорганизмах гликоген важен для выживания клеток, когда питательные вещества ограничиваются, а у высших организмов, таких как млекопитающие, синтез и деградация гликогена служат для буферизации уровня глюкозы в крови 1,2,3. Поэтому изучение метаболизма гликогена имеет важное значение для таких разнообразных областей, как микробиология и физиология млекопитающих. Понимание метаболизма гликогена требует изучения ключевых ферментов синтеза гликогена (глико....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Определение активности гликогенсинтазы
- Готовят исходные растворы необходимых реагентов, как указано в таблице 1 (до дня эксперимента).
| Компонент | Маршруты | |
| 50 мМ Трис pH 8.0 | Растворить 0,61 г основания Tris в ~ 80 мл воды. Охладить до 4 °C. Отрегулируйте pH до 8,0 с HCl и сделайте объем до 100 мл с водой. | |
| 20 мМ буфер HEPES | Растворить 0,477 г HEPES в ~ 80 мл воды. Отрегулируйте pH .... | |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Определение активности гликогенсинтазы
На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты анализов гликогенсинтазы с использованием очищенных ферментов. На панели А после небольшого отставания наблюдалось линейное снижение поглощения при 340 нм с течением времени в течение примерно 12 мин. Скорость изменения абсорбции на фиг.1А составила ~0,12 единицы поглощения/мин. Скорость изменения абсорбции между ~0,010 и ~0,20 единицы абсорбции/мин являе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В целом, ключевыми преимуществами всех представленных методов являются их низкая стоимость, легкость, скорость и отсутствие зависимости от специализированного оборудования. Основным недостатком, который они все разделяют, является чувствительность по сравнению с другими доступными методами. Чувствительность процедур, связанных с производством или потреблением NADH/NADPH, легко оценить. Учитывая, что коэффициент вымирания NADH/NADPH составляет 6,22 М-1 см-1, простая арифметика указывает на то, что из.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет никаких известных конфликтов интересов, связанных с этой работой, и не было никакой финансовой поддержки для этой работы, которая могла бы повлиять на ее результаты.
Благодарности
Автор хотел бы поблагодарить Каролин Диттмер и Эндрю Бриттингема за их идеи и множество полезных дискуссий. Эта работа была частично поддержана грантами Фонда остеопатического образования и исследований Айовы (IOER 03-17-05 и 03-20-04).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Амилопектин (без амилозы) из восковой кукурузы | Fisher Scientific | A0456 | |
| Amylose | Biosynth Carbosynth | YA10257 | |
| АТФ, динатриевая соль | MilliporeSigma | A3377 | |
| D-глюкоза-1,6-бисфосфат, калийная соль | MilliporeSigma | G6893 | |
| D-глюкоза-6-фосфат, натриевая соль | MilliporeSigma | G7879 | |
| Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, класс I, из дрожжей | MilliporeSigma | 10127655001 | |
| гликогена, тип II из устричных устриц | MilliporeSigma | G8751 | |
| Гексокиназа | MilliporeSigma | 11426362001 | |
| метакрилатных кювет, 1,5 мл | Fisher Scientific | 14-955-128 | Метакрилат требуется, поскольку некоторые процедуры проводится при 340 нм и ниже |
| &бета;-Никотинамидадениндинуклеотидфосфат Натриевая соль | MilliporeSigma | N0505 | |
| β-Никотинамид адениндинуклеотид, восстановленная динатриевая соль | MilliporeSigma | 43420 | |
| Нуклеозид 5'-дифосфаткиназа | MilliporeSigma | N0379 | |
| Фосфоенолпируват, монокалийная соль | MilliporeSigma | P7127 | |
| Фосфоглюкомутаза из мышц кролика | MilliporeSigma | P3397 | |
| Фосфорилаза А из мышц кролика | MilliporeSigma | P1261 | |
| Ферменты пируваткиназы/молочной дегидрогеназы из мышц кролика | MilliporeSigma | P0294 | |
| UDP-глюкоза, соль динатрия | MilliporeSigma | U4625 |
Ссылки
- Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
- Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasiti....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
