Traitement des échantillons protéomiques Shotgun automatisé par un robot de laboratoire open source

Summary

Un protocole détaillé et trois scripts Python sont fournis pour l’exploitation d’un système de manipulation robotique de liquides open source permettant d’effectuer une préparation semi-automatisée d’échantillons de protéines pour des expériences de spectrométrie de masse, couvrant l’élimination des détergents, la digestion des protéines et les étapes de dessalement des peptides.

Abstract

Les expériences de protéomique au fusil de chasse basées sur la spectrométrie de masse nécessitent plusieurs étapes de préparation des échantillons, y compris la digestion et le nettoyage des protéines enzymatiques, ce qui peut prendre des heures importantes de travail de laboratoire et présenter une source de variabilité de lot à lot. L’automatisation des laboratoires avec des robots de pipetage peut réduire le travail manuel, maximiser le débit et augmenter la reproductibilité de la recherche. Pourtant, les prix de départ élevés des stations d’automatisation standard les rendent inabordables pour de nombreux laboratoires universitaires. Cet article décrit un flux de travail de préparation d’échantillons protéomiques à l’aide d’un système d’automatisation open source abordable (The Opentrons OT-2), y compris des instructions pour mettre en place des étapes semi-automatisées de réduction des protéines, d’alkylation, de digestion et de nettoyage; ainsi que des scripts Python open source pour programmer le système OT-2 via son interface de programmation d’applications.

Introduction

La protéomique au fusil de chasse basée sur la spectrométrie de masse est un outil puissant pour mesurer simultanément l’abondance de nombreuses protéines dans des échantillons biologiques. Les expériences protéomiques avec l’analyse bioinformatique sont couramment utilisées pour identifier les biomarqueurs et découvrir les complexes biologiques associés et les voies qui sous-tendent les mécanismes pathologiques. Avec sa grande spécificité d’analyte et sa précision quantitative potentielle, la protéomique des fusils de chasse a également un excellent potentiel pour être adoptée par les installations de recherche et les laboratoires de diagnostic pour l’analyse d’échan....

Protocol

Les scripts Python développés ont été déposés sur GitHub à l’adresse : https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Une copie des scripts est remise dans le dossier supplémentaire 1. Veuillez vous référer au référentiel GitHub pour les dernières versions.

1. Préparations expérimentales

1. Vérifiez le matériel requis avant de démarrer le protocole.
   REMARQUE: Les composants matériels suivants sont requis: pipettes OT-2, embouts de pipette, ensemble de racks de tubes 4-en-1, ensemble de blocs en aluminium, module magnétique, module de température, plaques de puits de 96 puits de 2 mL....

Results

Trois scripts Python sont fournis ici qui sont compatibles avec le robot OT-2, et qui effectuent la préparation d’échantillons pour la protéomique de spectrométrie de masse avec une seule protéine albumine sérique bovine standard (répliques techniques n = 5 digestions) et un échantillon de lysat cardiaque humain contenant un détergent (n = 5 digestions). Chaque produit de digestion est divisé en deux réactions de nettoyage peptidique. Le nombre de correspondances peptide-spectre (MSP), de peptides et de protéines identif.......

Discussion

Étapes critiques du protocole
Pour de meilleures performances, des logiciels de laboratoire, des modules et des consommables compatibles avec OT-2 vérifiés par Opentrons doivent être utilisés. Des logiciels de laboratoire personnalisés peuvent être créés en suivant les instructions d’Opentrons à la référence ¹⁴. Assurez-vous de calibrer le pont OT-2, les pipettes et le matériel de laboratoire lorsqu’ils sont utilisés pour la première fois. Il est également essentiel de suivre l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 et micro ; Pointes de pipette L	Opentrons
supports de tubes 4 en 1	Opentrons		base et 4 couvercles de porte-tubes de 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml et 50 ml. Nous utilisons des couvercles de 2 ml et 15 ml + 50 ml dans cette étude.
Acclaim PepMap 100 C18 Colonne HPLC	Thermo Scientific	#164568	3 &mu ; p m ; 100 et Aring ; pore; 75 &mu ; m x 150 mm
Acetonitrile LC-MS grade	VWR	#JT9829
Ensemble de blocs	en aluminium Opentrons		Cet ensemble de blocs comprend 3 couvercles compatibles avec les tubes de 96 puits de 2,0 ml et une bande PCR à utiliser avec le module de température OT-2. Nous utilisons le support de tube de 2,0 ml dans ce manuscrit.
Bicarbonate d’ammonium	Sigma-Aldrich	# A6141
Étalon d’albumine sérique bovine, 2 mg/mL	Thermo Scientific	#23210
Diméthylsulfoxyde (DMSO) Grade LC-MS	Thermo Scientific	#85190
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	#D5545
Colonnes HPLC EASY-Spray	Thermo Scientific	#ES800A
EasynLC 1200 Nano LC	Thermo Scientific	#LC140
Ethanol Proof 195-200	Fisher	#04-355-720
Acide formique LC-MS grade	Thermo Scientific	#85178
Lysat de cœur humain	Novus Biologicals	NB820-59217
Iodoacétamide	Sigma-Aldrich	#I1149
Porte-tube	magnétiqueThermo Scientific	#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43			Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini centrifugeuse	Thermo Scientific	#75004061	mini-centrifugeuse de paillasse pour essorage rapide
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom	Opentrons
OT-2 module magnétique	Opentrons		GEN1
OT-2 P300 pipette monocanal	Opentrons		GEN1
OT-2 P50 pipette monocanal	Opentrons		GEN1
OT-2 robot pipetateur	robot Opentrons	OT-2 OT-2
module de température	Opentrons		GEN1
Pierce Dosage colorimétrique quantitatif des peptides	Thermo Scientific	#23275
Tubes Protein LoBind 2.0 mL	Eppendorf	#022431102
Base de données de séquences de protéines	UniProt/SwissProt		https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640 % 20reviewed :oui
Sera-Mag SpeedBead Particules magnétiques modifiées au carboxylate,	Cytiva	#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Particules magnétiques modifiées au carboxylate, Hydrophile	Cytiva	#45152105050250
SpeedVac	Thermo Scientific		Évaporateur sous vide
Thermo Q Exactive HF Spectromètre de masse	Thermo Scientific	#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsine MS Grade	Thermo Scientific	#90057
Eau LC-MS grade	VWR	#BDH83645.400