Method Article

3D-визуализация внеклеточного матрикса печени на мышиной модели неалкогольного стеатогепатита

DOI:

10.3791/63106

⸱

February 25th, 2022

 ,  ,  , 
1Gastroenterology and Hepatology, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол оптимизирует методы перфузии/децеллюляризации печени in situ и двухфотонной микроскопии для создания надежной платформы для визуализации динамики ремоделирования внеклеточного матрикса (ECM) при неалкогольном стеатогепатите (НАСГ).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является наиболее распространенным хроническим заболеванием печени в Соединенных Штатах, поражающим более 70 миллионов американцев. НАСГ может прогрессировать до фиброза и, в конечном итоге, до цирроза, значительного фактора риска гепатоцеллюлярной карциномы. Внеклеточный матрикс (ECM) обеспечивает структурную поддержку и поддерживает гомеостаз печени с помощью матрицеллюлярных сигналов. Фиброз печени возникает в результате дисбаланса в динамическом процессе ремоделирования ECM и характеризуется чрезмерным накоплением структурных элементов и связанными с этим изменениями гликозаминогликанов. Типичная картина фиброза НАСГ называется «куриной проволокой», которая обычно состоит из перисинусоидального / перицеллюлярного фиброза зоны 3, основанного на особенностях, наблюдаемых трихромным пятном Массона и красными пятнами Picrosirius. Тем не менее, эти традиционные методы визуализации на основе тонких двумерных (2D) тканевых слайдов не могут продемонстрировать подробные трехмерные (3D) структурные изменения ECM, что ограничивает понимание динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени.

Текущая работа оптимизировала быстрый и эффективный протокол для визуализации нативной структуры ECM в печени посредством децеллюляризации для решения вышеуказанных проблем. Мышей кормили либо чау-чау, либо фаст-фудом в течение 14 недель. Децеллюляризацию проводили после перфузии воротной вены in situ , а методы двухфотонной микроскопии применяли для визуализации и анализа изменений в нативной ECM. Были восстановлены и проанализированы 3D-изображения нормальной печени и печени с НАСГ. Выполнение перфузионной децеллюляризации in situ и анализ каркаса с помощью двухфотонной микроскопии обеспечили практичную и надежную платформу для визуализации динамического ремоделирования ECM в печени.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является наиболее распространенным заболеванием печени, поражающим 20-25% взрослого населения. У 25% пациентов с НАЖБП прогрессирует до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), при котором повышается риск цирроза печени, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы1. По оценкам, в ближайшие 20 лет на долю НАСГ будет приходиться 2 миллиона смертей, связанных с печенью, в США2. Поскольку не существует утвержденных методов лечения, существует острая необходимость в расшифровке механизмов, вызывающих фиброз печени у пациентов с НАСГ, и разработке целенаправленного лечения....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных проводятся в соответствии с экспериментальными процедурами, утвержденными институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) Стэнфордского университета и Госпиталя по делам ветеранов в Пало-Альто. 6-8-недельных мышей-самцов C57BL / 6J кормили либо чау-чау, либо диетой быстрого питания с добавлением 4,2% кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (см. Таблицу материалов) в питьевой воде в течение 14 недель5. Мышей содержали в стандартных клетках в течение 12 часов в темно-светлом цикле.

1. Хирургическая подготовка и процедуры перфузии п....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коллагеновые волокна были обнаружены с помощью генерации второй гармоники и двухфотонной микроскопии. Сигнал исходит от хрупких тройных спиральных и нативных фибриллярных коллагеновых структур. Специфические антитела не использовались для анализа подтипов коллагена; Тем не менее, это может быть добавлено к технике визуализации.

Когда ткань печени изучается без децеллюляризации, сложно получить изображения коллагеновой сети с высоким разрешением (рис. 5А).<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол показывает, что децеллюляризация с помощью перфузии DOC in situ с низкой скоростью потока сохраняет хрупкие структуры тройной спирали и нативного фибриллярного коллагена, обеспечивая надежную и экономичную платформу для динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени НАСГ. Несмотря на то, что децеллюляризация проводилась в нормальной и фиброзной печени до идентификации компонентов ECM или создания биологических каркасов для клеточной культуры, динамика ремоделирования ECM при фиброзе пече.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данной статьи.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим Hyesuk Park за техническую помощь. Это исследование было поддержано финансированием Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, в NJT), Национального института старения (NIA), NIH (1R01AG060726, в NJT). Мы выражаем благодарность Джону Малхолланду (Jon Mulholland) и Китти Ли (Kitty Lee) из Центра клеточных наук (Cell Sciences Imaging Facility) Центра Бекмана (Beckman Center) за техническую помощь в проведении двухфотонной микроскопии.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-0 МОНОКРИЛ НЕОКРАШЕННЫЙ 1 x 18" P-3МОНОКРИЛY494G
4-0 шовFisher Scientific10-000-649https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (ксилазин)AnaSedNDC 59399-110-20этот препарат для использования лицензированным ветеринаром или по его заказу.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. КАТЕТЕР С ТЕХНОЛОГИЕЙ BC
Chow диетаEnvigo# 2918Control diet. Фиксированная формула, не подлежащая автоклавированию, изготовленная из высококачественных ингредиентов и предназначенная для поддержки беременности, лактации и роста грызунов.
Диета быстрого приготовления (AIN76A Западная диета)Тестовая диета1810060https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
гематоксилина и эозина Stain KitvectorlabsH-3502https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kitfisher scientific13-005-205https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
КЕТАМИНА ГИДРОХЛОРИД ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙVedcoNDC 50989-996-06 - 10 мл - флакон.КетаВед был клинически изучен на приматах недочеловеков в дополнение к видам, перечисленным в разделе «Применение и дозировка».
Leica SP5 вертикальный Confocal, многофотонныйLeicaSP5
Luer (трехпозиционный запорный кран с SPIN-LOCK®)bbraunD300https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain KitPolysciences, Inc.24901https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Аппликатор с вискозным наконечникомпуритан25-806 1PR
Дезоксихолат натриясигмалдричD6750-100G
Сиропwww.target.com24 жидкими унциямиhttps://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
перистальтическим насосом с регулируемой скоростьюINTLLABBT100https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumvectorlabsH-1000-10https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html
382612 разъем

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
  2. Ye, Q., et al. Global prevalence, incid....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liver Extracellular MatrixNon Alcoholic SteatohepatitisECM RemodelingLiver FibrosisDecellularization ProtocolTwo Photon MicroscopyCollagen FibersMouse Liver ImagingPicrosirius Red StainingPortal Vein Perfusion

Related Articles