당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
당뇨병성 망막병증과 같은 후부 절편 안구 질환은 망막의 생리학을 변화시킵니다. 당뇨병성 망막병증은 망막 박리, 혈액-망막 장벽(BRB)의 붕괴, 및 망막 혈관신생을 특징으로 한다. 생체 내 쥐 모델은 망막의 구조와 기능의 변화를 조사하는 데 유용한 실험 도구입니다. 우리는 망막 세포, 망막 혈관 구조 및 손상된 BRB의 형태 학적 변화를 확인하기 위해 쥐 모델에서 세 가지 실험 기술을 제안합니다. 망막 조직학은 다양한 망막 세포의 형태를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 정량적 측정은 망막 세포 수 및 상이한 망막층의 두께 측정에 의해 수행된다. BRB 분해 분석은 BRB의 분해로 인한 혈장에서 유리체 조직으로의 안구 외 단백질의 누출을 결정하는 데 사용됩니다. 형광 혈관 조영술은 FITC-덱스트란 염료를 사용하여 망막 혈관 구조를 시각화하여 혈관 신생 및 혈관 누출을 연구하는 데 사용됩니다.
서론
당뇨병성 망막병증(DR)은 진성 당뇨병의 가장 복잡한 이차적 합병증 중 하나이다. 또한 전 세계 노동 연령 인구에서 예방 가능한 실명의 주요 원인이기도합니다. 32.4 만 명의 시각 장애인에 대한 최근의 메타 분석에서 830,000 (2.6 %)의 사람들이 DR1로 인해 시각 장애인이었습니다. 당뇨병으로 인한 시력 손실의 비율은 2015 년 전 세계적으로 1.06 % (0.15-2.38)로 7 위를 차지했습니다 2,3.
당뇨병성 망막병증은 후부 안구 조직의 혈관 이상에 의해 진단된다. 임상적으로, 망막에서의 혈관화에 기초한 비증식성 DR (NPDR) 및 증식성 DR (PDR)의 두 단계로 나뉘어진다. 고 혈당증은 망막의 신경 변성4,5, 염증6,7 및 미세 혈관 구조8에 관련된 여러 경로를 암시하기 때문에 DR의 강력한 조절제로 간주됩니다. 고혈....
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프로토콜
이 프로토콜은 기관 동물 윤리위원회, BITS-Pilani, 하이데라바드 캠퍼스에서 제공하는 모든 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. 망막 조직학
- 눈의 핵형성 및 고정
- 복강내 경로를 통해 주사된 고용량의 펜토바르비탈(150mg/kg)을 사용하여 연령 일치 대조군(14~15주령)과 함께 2~3개월 된 당뇨병성 위스타 수컷 쥐를 안락사시킨다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이내에 사망을 확인하지 못합니다.
- 눈의 비강 및 측두엽 부위에 메스 블레이드를 사용하여 절개를하여 눈을 에핵화하십시오. 그런 다음 포셉과 마이크로 가위를 사용하여 가장자리를 따라 자르면 오비탈 소켓에서 눈을 제거합니다.
참고 : 쥐를 희생하기 전에 고정 솔루션을 준비하십시오.
주의: 포름알데히드는 피부, 눈, 코 및 호흡기를 자극합니다. 또한 강력한 피부 감작제이기 때문에 암을 유발할 수 있습니다. 장갑을 끼고 후드 아래에서 다루십시오21. - 페트리 접시에 인산완충식염수(PBS) 용액 10mL로 눈을 깨끗이 씻어 혈액을 제거한다. 고정 용액의 쉬운 침투를 위해 눈 주위의 과도한 지방을 제거하십시오.
- 포셉....
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결과
망막 조직학
당뇨병성 망막에서 망막 세포는 변성을 겪습니다. 또한, 부종으로 인해 망막층의 두께가 증가합니다.22. Hematoxylin 및 Eosin 염색 후에 얻어진 이미지는 ImageJ를 사용하여 도 2 에 도시된 바와 같이 세포 수 및 상이한 층의 두께의 측정에 사용될 수 있다.
혈액-망막 장벽 파괴 분석
BRB가 당뇨병 쥐에서 손상됨에 따라 누출이 두드러지며 혈장에서 망막 및 유리체로 생체 분자가 축적됩니다. 당뇨병 쥐에서 혈장에서 유리체로의 단백질 누출은 건강한 쥐와 비교할 때 약 3 배 더 높습니다 (그림 3). 단백질은 Lowry 방법, Bicinchoninic acid (BCA) 방법 또는 Bradford 방법 (이 논문, 섹션 2.3에서 언급).......
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토론
조직학
망막 조직학은 망막 세포 및 층의 형태학적 변화를 시각화하기 위해 수행된다. 고정 용액 선택, 고정 기간, 탈수 및 파라핀 함침을 포함한 다양한 단계를 최적화해야합니다. 조직 크기는 고정 침투가 느려지기 때문에 3mm를 초과해서는 안됩니다. 일반적으로 사용되는 4 % 파라 포름 알데히드는 수성 유머 및 유리체 유머에 비해 용액의 상대적으로 높은 삼투압으로 인해 건강한 눈에서도 망막 박리를 일으켜 위양성 결과를 초래합니다23. 용액의 높은 삼투압은 부피 수축을 초래하고 조직의 수축을 초래합니다. 이 프로토콜에 사용 된 고정 용액은 1 % 포름 알데히드와 1.25 % 글루타르 알데히드로, 상대적으로 적은 삼투압을 가지며, 조직 왜곡을 줄이며, 망막 색소 상피층으로부터의 망막 박리를 최소화하고, 또한 구조를 원래 상태로 보존합니다. 고정 용액의 또 다른 선택은 포름 알데히드가있는 아세트산과 에탄올입니다. 고정 용액의 산성 상태는 조직의 신속한 고정에.......
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공개 사항
저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 인도 의학 연구위원회 (ICMR; ITR-2020-2882) 박사 Nirmal J.에 대한 자금 지원 우리는 또한 인프라 시설을 제공 한 Manisha Malani 및 Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad 캠퍼스에 주니어 연구 펠로우십을 제공 한 University Grant of Commission에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | 마취제 | |
| 케타민 염산염 | Troikaa Pharmaceuticals | 마취제 | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | 마취제 | |
| 펜토바르비탈 나트륨 | Zora Pharma | 안락사 에이전트 | |
| 고정액 (1 % 포름 알데히드, 1.25 % 글루 타르 알데히드 | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | 사내 에 |
| 탄올 | Hayman | F204325 | 탈수 |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | 에탄올 또는 파라핀 파라 |
| HiMedia | GRM10702 | 조직 | |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | 알부민 코팅 슬라이드를 준비합니다. 글리세롤과 난자 알부민을 1:1 비율로 혼합하여 슬라이드에 코팅합니다 |
| 염산 | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | 1 % 산성 알코올 |
| 아세트산 | HiMedia | AS119 | 제조 에 |
| 스콧 물 | Leica | 3802900 | 블루 링 시약 |
| Papanicolaou 용액 1b Hematoxylin 용액 | Sigma | 1.09254.0500 | 핵 염색 |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | 세포질 염색, 0.25 % 용액 준비 사내 |
| DPX 마운트 미디어 | Sigma | 6522 | 망막 섹션의 시각화 및 보호 |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| 각막 겸자 | Stephens Instruments | S5-1200 | 해부 |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | 해부 |
| 곡선 마이크로 가위 | Stephens Instruments | S7-1311 | 해부 |
| Vannas 가위 | Stephens Instruments | S7-1387 | 해부 |
| 아이리스 가위 | Stephens Instruments | S7-1015 | 해부 |
| 카세트 | HiMedia | PW1292 | 조직학 처리 중 조직 유지 |
| 조 | GT Sonic | GT Sonic-D9 | 온도 유지 파라 |
| 핀 임베딩 스테이션 | Myr | EC 350 | 파라핀 블록 준비 |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | 단면 |
| 블레이드 | Leica | Leica 818 | 단면 |
| 슬라이드 | HiMedia | BG005 | 파라핀 조직 단면 고정 |
| 커버슬립 | HiMedia | BG014C | 장착 매체 추가 후 조직을 덮으려면 |
| Blood Retinal Barrier Breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | 해당 사항 없음 | 사항 없음 | Dissection |
| Bradford 시약 | Sigma | B6916 | 단백질 정량 |
| 화 < 강한>장비 < / 강> | |||
| 각막 겸자 | Stephens Instruments | S5-1200 | 해부 |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | 해부 |
| 곡선 마이크로 가위 | Stephens Instruments | S7-1311 | 해부 |
| Vannas 가위 | Stephens Instruments | S7-1387 | 해부 |
| 아이리스 가위 | Stephens Instruments | S7-1015 | 해부 |
| 유리 제품 | Borosil | 해당 사항 | |
| EDTA 코팅 튜브 | J.K 진단 | 해당 없음 | 에서 플라즈마 분리 |
| MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | 유리체 | |
| 균질화 캡 | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | 의 균질화 |
| MP Biomedicals | SKU: 116914801 | 유리체의 균질화 | |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | 의 균질화 |
| - 투명 | Grenier | GN655101 | 단백질 정량 플레이트 |
| 리더 | 분자 소자 | SpectrMax M4 | 흡광도 측정 |
| 원심분리기 | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (Sigma의 FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran 및 Dibutylin dilaurate; HiMedia | FITC-F3651, Dextran-31390, Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | 내 |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | 퇴색 방지 장착 매체 |
| Equipments | |||
| 각막 겸 | Stephens Instruments | S5-1200 | 해부 |
| Colibri 겸자 | Stephens Instruments | S5-1135 | 해부 |
| 곡선 마이크로 가위 | Stephens Instruments | S7-1311 | 해부 |
| Vannas 가위 | Stephens Instruments | S7-1387 | 해부 |
| 아이리스 가위 | Stephens Instruments | S7-1015 | 해부 |
| 유리 제품 | Borosil | 해당 없음 | |
| 슬라이드 | HiMedia | BG005 | 플랫마운트 준비 |
| 커버슬립 | HiMedia | BG014C | 마운팅 미디어 추가 후 조직을 덮기 위해 |
| 컨포칼 현미경 라이 | 카 | DMi8 | 플랫마운트 시각화 |
참고문헌
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al.
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