Method Article

عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من عينات الأنسجة غير المتجانسة المجمدة بدون فرز الخلايا

DOI:

10.3791/63143

⸱

December 8th, 2021

 , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى عزل mRNAs الريبوسومية المترجمة الخاصة بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل عدم التجانس الخلوي تحديات لفهم وظيفة الأنسجة المعقدة على مستوى النسخ. يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية إلى تجنب المزالق المحتملة الناجمة عن عدم تجانس الأنسجة ويطلق العنان لتحليل النسخ القوي. يوضح البروتوكول الموصوف هنا كيفية استخدام طريقة تنقية تقارب الريبوسوم المترجم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من كمية صغيرة من الخلايا المعبرة عن EGFP في نسيج معقد دون فرز الخلايا. هذا البروتوكول مناسب لعزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP المتاح مؤخرا ويمكن استخدامه أيضا لعزل الحمض النووي الريبي عن أي خلايا تعبر عن EGFP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مكنت النهج عالية الإنتاجية ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) والمصفوفات الدقيقة ، من استجواب ملفات تعريف التعبير الجيني على مستوى الجينوم. بالنسبة للأنسجة المعقدة مثل القلب والدماغ والخصية ، ستوفر البيانات الخاصة بنوع الخلية مزيدا من التفاصيل التي تقارن استخدام الحمض النووي الريبي من الأنسجة بأكملها1،2،3. للتغلب على تأثير عدم التجانس الخلوي ، تم تطوير طريقة ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) منذ أوائل عام 20104. TRAP قادر على عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من أنواع خلايا معينة دون تفكك الأنسجة. تم استخدام هذه الطريقة لتحليل t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتبعت جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات البروتوكولات المعتمدة من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة أوبورن.

ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي خصية واحدة (حوالي 100 ملغ) في P28 من Gli1-CreERT2 ؛ فئران NuTRAP (Mus musculus). قد تحتاج أحجام الكواشف إلى التعديل بناء على أنواع العينات وعدد الأنسجة.

1. جمع الأنسجة

  1. القتل الرحيم للفئران باستخدام غرفة CO2 ، وتطهير سطح البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.
  2. افتح أسفل البطن بالمقص وأزل الخصيتين. استخدم النيتروجين السائل (LN2) لتجميد الخصيتين على الفور.
  3. قم ب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عبور الماوس Gli1-CreERT2 (رقم مخزون مختبر جاكسون: 007913) لأول مرة باستخدام فأر مراسل NuTRAP (رقم مخزون مختبر جاكسون: 029899) لتوليد فئران مزدوجة التحول. تم حقن الفئران التي تحمل أليلات الجينات المعدلة وراثيا (أي Gli1-CreERT2 و NuTRAP) بعقار تاموكسيفين مرة واحدة يوميا ، كل يومين ، لثلاث حقن. تم جمع عينات الأنسجةفي اليوم 7 بعد اليوم 1من الحقن. أظهر تحليل التألق المناعي أن EGFP تم التعبير عنه في الخلايا الخلالية في الخصيتين (الشك.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تخفف فائدة تحليل نسخ الأنسجة الكاملة ، خاصة عند دراسة الأنسجة غير المتجانسة المعقدة. تصبح كيفية الحصول على الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية حاجة ملحة لإطلاق العنان لتقنية RNA-seq القوية. عادة ما يعتمد عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية على جمع نوع معين من الخلايا باستخدام المعالجة الدقيقة أو فرز الخلايا المنشط بالفلورسنت (FACS) أو التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM)18. كما تم تطوير طرق وأدوات حديثة أخرى عالية الإنتاجية لجمع خلية واحدة19. تستخدم هذه الطر.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا بواسطة NIH R00HD082686. نشكر زمالة الأبحاث الصيفية لجمعية الغدد الصماء إلى H.S.Z. كما نشكر الدكتور يوان كانغ على تربية مستعمرة الفئران والحفاظ عليها.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Actb< / em>eurofinsqPCR بادئاتATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTTTGCAGCTCCTTCGTT (برايمر أمامي / برايمر عكسي)
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini خالي من EDTA مثبط البروتياز كوكتيلميليبور11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1< / em>eurofinsqPCR بادئاتCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (برايمر أمامي / برايمر عكسي)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT ، DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 مغناطيسThermo Fisher Scientific12321D
أنابيب فالكون 15 ملVWR89039-666
GFP الأجسام المضادةAbcamab290
مجموعة المطحنة الزجاجيةDWK Life Sciences357542
الهيبارينBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
em>Hsd3b< / em>eurofinsqPCR بادئاتGACAGGAGCAGGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (التمهيدي الأمامي / التمهيدي العكسي)
KClBiosciencesR005
MgCl 2< / sub>BiosciencesR004
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 ملThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay MicroarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT) 20Invitrogen18418020
PicoPure RNA IsolationKit Thermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase خاليةخلايا الزراعةالمائية NUPW-0500
RNaseOUT مثبط ريبونوكلياز المؤتلفالحراري فيشر Scientific10777019
Sox9< / em>eurofinsqPCR الاشعالTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (التمهيدي الأمامي / التمهيدي العكسي
Superscript IV النسخ العكسيInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3< / em>eurofinsqPCR primersGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA / GAACTGCTCGTGTGTGTGTGTGTGTTTGGTA (برايمر أمامي / برايمر عكسي)
تريسألفا إيسارJ62848
< من

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
  2. Soumillon, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Type Specific RNATranslating Ribosome Affinity PurificationRibosome Bound RNAEGFP Expressing CellsNuTRAP Mouse ModelRNA PurificationMagnetic Bead IsolationMicroarray AnalysisQuantitative RT PCRTissue Homogenization

Related Articles