تسمح المنصة المحسنة لزراعة الأجنة بأكملها بالتطور المستمر والقوي خارج الرحم لأجنة الفئران بعد الزرع لمدة تصل إلى ستة أيام ، من مراحل ما قبل المعدة حتى التكوين العضوي المتقدم. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل الإجراء القياسي لزراعة الأجنة الناجحة باستخدام لوحات ثابتة وأنظمة زجاجات دوارة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خارج الرحم زراعة أجنة الفئران من ما قبل المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كانت طرق زراعة أجنة الثدييات بعد الزرع غير فعالة بشكل عام وتقتصر على فترات قصيرة بعد تشريح الرحم. تم تطوير منصات مؤخرا لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم القوية والمطولة للغاية من مراحل أسطوانة البيض حتى التكوين العضوي المتقدم. تتيح هذه المنصات التطور المناسب والأمين للأجنة قبل المعدة (E5.5) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (E11). تزرع الأجنة المتأخرة في المعدة (E7.5) في زجاجات دوارة في هذه الإعدادات ، في حين أن الثقافة الموسعة من مراحل ما قبل المعدة (E5.5 أو E6.5) تتطلب مزيجا من مزارع الزجاجات الثابتة والدوارة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنظيم الحساس لتركيز O2 و CO2 ، وضغط الغاز ، ومستويات الجلوكوز ، واستخدام وسط معين خارج الرحم أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين السليم. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم الموسعة. تمثل القدرة على نمو أجنة الفئران الطبيعية خارج الرحم من المعدة إلى التكوين العضوي أداة قيمة لتوصيف تأثير الاضطرابات التجريبية المختلفة أثناء التطور الجنيني.
المقدمة
وقد حد التطور داخل الرحم لجنين الثدييات من دراسة المراحل المبكرة من تطور ما بعد الزرع1,2. إن عدم إمكانية الوصول إلى الجنين النامي يعيق فهم العمليات التنموية الرئيسية التي تحدث بعد زرع الجنين في الرحم ، مثل إنشاء خطة جسم الحيوان ، أو مواصفات الطبقات الجرثومية ، أو تكوين الأنسجة والأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن الحجم الصغير جدا للجنين المبكر بعد الزرع يجعل من الصعب ملاحظته عن طريق التصوير داخل الجسم في الرحم قبل E103. إن عدم القدرة على مراقبة الأجنة الحية ومعالجتها في هذه المراحل قد حد من دراسة التكوين المبكر للأجنة بعد الزرع إلى لقطات أثناء النمو.
بروتوك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات حماية الحيوان الصادرة عن معهد وايزمان للعلوم والمعتمدة من قبل معهد وايزمان ذي الصلة IACUC (# 01390120-1 ، 01330120-2 ، 33520117-2). طلب من النساء الحوامل الأصحاء إعطاء موافقتهن المستنيرة على جمع الدم من الحبل السري، على النحو الذي وافقت عليه لجنة هلسنكي في مركز رامبام الطبي (#RMB-0452-15). طلب من البالغين الأصحاء موافقتهم المستنيرة على جمع الدم وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة هلسنكي التابعة لمعهد وايزمان للعلوم (#1566-3).
1. الإعداد الإعلامي
- تحضير وسط التشريح باستخدام 500 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) بدون الفينول الأحمر والجلوتامين L ، مع استكمال 10٪ مصل ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تدعم ظروف زراعة الأسطوانة الموصوفة للأجنة E7.5 (مرحلة أواخر المعدة) نمو الجنين المستمر والطبيعي بمتوسط كفاءة يقترب من 75٪ بعد 4 أيام من الزراعة (الشكل 2 والجدول 1). قد تختلف كفاءة نمو الجنين عبر الخلفيات الوراثية المتنوعة للفئران ولكنها قوية باستمرار (الشكل 2C). المكملات الغذائية مع HBS بدلا من HCS تعطي كفاءة ~ 68 ٪ بعد 4 أيام من ثقافة خارج الرحم ، وهذا يتوقف على الخلفية الوراثية للفئران (الشكل 2D و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن لبروتوكول الاستزراع المقدم هنا الحفاظ على التطور السليم والمستمر لجنين الفئران خارج الرحم لمدة تصل إلى ستة أيام ، من E5.5 إلى E11. في السابق، كانت الأجنة في مراحل النمو هذه تتطور بشكل طبيعي في الثقافة فقط لفترات قصيرة (تصل إلى 48 ساعة)15. يعد اقتران وحدة تنظيم الغاز بحاضنة زراعة الأسطوانة للتحكم الدقيق في تركيز الأكسجين وضغط الغاز عالي الضغط أمرا بالغ الأهمية لزراعة أجنة الفئران المناسبة الموضحة هنا. إن زيادة ضغط الغاز إلى 7 رطل لكل بوصة مربعة يعزز انتشار الأكسجين ، مما يسمح بتطور ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
J.H.H هو مستشار لشركة Biological Industries Ltd وقدم طلب براءة اختراع يغطي ظروف الثقافة الدوارة والثابتة الموضحة هنا (قدمها J.H.H. ومعهد وايزمان للعلوم). مؤلفون آخرون يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل باسكال وإيلانا مانتو. مجلس البحوث الأوروبي (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety) ؛ مجلس البحوث الطبية لمضيفات الطيران (FAMRI) ؛ أستاذية الصندوق الإسرائيلي لأبحاث السرطان (ICRF) ، BSF ، معهد هيلين ومارتن كيميل لأبحاث الخلايا الجذعية ، جائزة هيلين ومارتن كيميل للتحقيق المبتكر ؛ مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF)، مينيرفا، معهد شيرمان للكيمياء الطبية، مركز نيلا وليون بينوزيو للأمراض العصبية، مركز عائلة ديفيد وفيلا شيبيل لأبحاث الاضطرابات الوراثية، معهد كيكست العائلي لعلم الوراثة الطبية، صندوق أبحاث الخلايا الجذعية للدكتور بيث روم-رايمر، مؤسسات إدموند دي روتشيلد، مؤسسة زانتكر الخيرية، مزرعة زفيا زيروني.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.22 وميكرو ؛ مرشح حجم المسام (250 مل) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 & micro ؛ م حقنة بحجم المسام مرشح PVDF | Millipore | SLGV033RS | |
| 8 آبار وألواح صغيرة قاع زجاجي / ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| زجاجة مع غطاء محول لمدخل الغاز | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. هندسة ، كولوم ستار الهندسة الدقيقة | BTC 06 | تستخدم لإغلاق الزجاجات بالأسطوانة |
| Bungs (صلبة) | B.T.C. الهندسة ، كولوم ستار الهندسة الدقيقة | BTC 07 | تستخدم لإغلاق زجاجات الثقافة الدوارة الأسطوانة |
| B.T.C. الهندسة ، كولوم ستار الهندسة الدقيقة | BTC 03 / BTC 04 | إما زجاجات زجاجية (صغيرة) BTC 03 أو زجاجات زجاجية (كبيرة) BTC 04 | |
| D (+) - جلوكوز مونوهيدرات | جي تي بيكر | ||
| سكين ماسي | أدوات العلوم | الدقيقة 10100-30 / 45 | |
| مقياس الضغط الرقمي | شنغهاي Benxu Electronics Technology Co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-020-1A | |
| مصل الأبقار الجنيني | الصناعات البيولوجية | 04-013-1A | |
| وحدة تنظيم الغاز | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| جلوتاماكس | جيبكو | 35050061 | الجلوتامين |
| Graefe | أدوات العلوم الدقيقة | 11052-10 | |
| ملقط HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| الجراحة المجهرية (دومون # 5 ، # 55) | أدوات العلوم الدقيقة | 11255-20 | |
| ماصات باستور (زجاج) ماصات | هيلجنبرغ | 3150102 | |
| باستور (بلاستيك) | Alexred | SO P12201 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | الصناعات البيولوجية | 03-031-1B | |
| أطباق بتري (60 مم و 100 مم) | Falcon | 351007 / 351029 | |
| نظام حاضنة دقيق | B.T.C. هندسة ، نموذج Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 مع مجموعة فقاعات الغاز |
| اختبار معقمة Pro-coagulant (5 مل) | Greiner Bio-One | # 456005 | |
| مصل زراعة الجنين الكامل للجرذ | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| مجهر مجهر مجسمة مزود بلوحة تسخين | محاقن نيكون | SMZ18 | |
| معقمة (5 ، 10 مل) لترشيح المصل | مقص جراحي لحل | ||
| أدوات العلوم | الدقيقة 14094-11 |
المراجع
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
