体外药物筛选靶向表达β-半乳糖苷酶的克氏锥虫全生命周期阶段

摘要

我们描述了一种高通量比色法，用于检测引起恰加斯病的病原体——克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）在其生命周期三个阶段中的β-半乳糖苷酶活性。该方法可简便、快速且可重复地用于筛选具有杀锥虫活性的化合物。

摘要

Trypanosoma cruzi 是恰加斯病（ChD）的致病原，该病是拉丁美洲具有重要公共卫生意义的地方性疾病，由于人口迁移增加，也影响许多非流行国家。此疾病影响近800万人，每年估计新增病例5万例。在20世纪60年代和70年代，两种用于治疗恰加斯病的药物被引入：硝呋莫司和苄硝唑（BZN）。这两种药物在新生儿及疾病急性期均有效，但在慢性期无效，且使用时伴随显著的不良反应。这些事实凸显了迫切需要加强针对T. cruzi的新药研发工作。

T. cruzi 通过猎蝽科和半翅目昆虫的吸血节肢动物媒介传播。进入哺乳动物宿主后，它以内无鞭毛体形式在细胞内增殖，并分化为血液中不复制但具有感染性的锥鞭毛体。在昆虫媒介体内，锥鞭毛体转变为前鞭毛体阶段，并通过二分裂方式进行增殖。

本文介绍了一种基于检测寄生虫裂解后释放到培养液中的胞质β-半乳糖苷酶活性的检测方法，所用底物为氯酚红β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）。为此， T. cruzi Dm28c 菌株转染了过表达 β-半乳糖苷酶的质粒，并用于 体外 在上鞭毛体、无鞭毛体和前鞭毛体阶段进行药物筛选。本文还描述了如何利用参考药物苯硝唑作为示例，测定培养的上鞭毛体、感染无鞭毛体的Vero细胞以及从培养细胞中释放出的前鞭毛体的酶活性。该比色法检测操作简便，可扩展为高通量形式，并适用于其他研究 T. cruzi 菌株。

引言

恰加斯病（ChD），又称美洲锥虫病，是由一种具鞭毛的原生动物克氏锥虫（Trypanosoma cruzi，简称 T. cruzi）引起的寄生虫病。该病最初为无症状或症状轻微的急性期，通常未被诊断，随后进入终身持续的慢性期。在慢性阶段，约30%的患者在感染数十年后出现多种致残性疾病，包括心肌病、巨脏器综合征或两者兼有，死亡率介于0.2%至20%之间^1,2,3。无症状的慢性期患者可能无任何临床表现，但终生保持血清学阳性。

据估计，全球约有700万人感染，其中大多数来自恰加斯病（ChD）流行地区的拉丁美洲。T. cruzi 主要通过受感染的吸血锥蝽（媒介传播）传播，较少情况下通过摄入被含有寄生虫的锥蝽粪便污染的食物经口传播²。此外，该寄生虫还可通过胎盘从感染恰加斯病的母亲传给新生儿，或通过输血及器官移植传播。这些非媒介传播途径以及人口迁移促进了该疾病在全球范围内的扩散，北美、欧洲以及部分非洲、东地中海和西太平洋地区的病例数量不断增加即是明证⁴。恰加斯病被视为一种被忽视的疾病，因为其媒介传播与贫困密切相关，是拉丁美洲低收入国家重要的公共卫生问题。尽管已....

方案

注意：整个实验设计的概述见图1。

图1：使用CPRG作为比色反应底物对Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ株进行体外筛选检测的总体流程。 该检测包括接种寄生虫（1），用BZN孵育（2和3），然后加入比色底物（4）。当寄生虫裂解时，β-半乳糖苷酶被释放，并将CPRG裂解为氯酚红；该颜色变化可通过分光光度法测定（5）。数据可在统计分析软件中进行分析，以获得BZN的半数抑制浓度（IC₅₀）。缩写：CPRG = 氯酚红 β-D-半乳吡喃糖苷；BZN = 苯硝唑。

结果

按照上述方案，将表达β-半乳糖苷酶的Dm28c无鞭毛体与6种浓度的BZN（2.5、5、10、20、40、80 µM）（或待测化合物）在37°C下孵育72小时。孵育结束后，加入CPRG试剂和去污剂，后者可裂解细胞并释放β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶可切割CPRG生成氯酚红，导致溶液颜色由黄色变为红褐色（图2A）。2小时后，使用酶标仪在595 nm波长处测定氯酚红的吸光度。以BZN的对数浓度为横坐标，595 nm处的吸光度为纵坐标绘制XY曲线图，并采用非线性回归拟合曲线（图2B）。在本实验中，无鞭毛体的IC₅₀值为20.59 ± 1.075 µM，与文献报道结果相似（表I）^16,17。此前已有研究报道该方法在动基体和无鞭毛体中的代表性结果¹³。

讨论

本文介绍了一种基于检测细胞膜裂解后释放的胞质β-半乳糖苷酶活性的检测方法，该方法适用于在底物CPRG存在下裂解T. cruzi无鞭毛体、上鞭毛体或含有无鞭毛体的感染细胞。我们使用了T. cruzi Dm28c/pLacZ寄生虫，这是一种通过转染携带β-半乳糖苷酶的质粒而获得的稳定寄生虫株，该质粒由Buckner及其合作者构建¹⁰。该检测方法已被用于筛选抗锥虫化合物^12,19,20,21。本研究采用T. cruzi Dm28c/pLacZ菌株优化了筛选方案。如图1所示，该方案包含四个主要步骤：第一步是在96孔板中接种寄生虫。上鞭毛体和无鞭毛体从悬浮液中计数后进行接种；对于无鞭毛体，则首先接种Vero细胞以形成贴壁单层，随后用上.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 烧杯	Schott Duran	10005227
10 mL 血清移液管，无菌	Jet Biofil	GSP211010
5 mL 血清移液管，无菌	Jet Biofil	GSP010005
96 孔板	Corning	3599
苯并咪唑	Sigma Aldrich	419656	N-苄基-2-硝基-1H-咪唑-1-乙酰胺
生物安全柜	Telstar	Bio II A/P
15 mL 圆底离心管，无菌	Tarson	546021
50 mL 圆底离心管，无菌	Tarson	546041
CO2 培养箱	Sanyo	MCO-15A
CPRG	Roche	10 884308001	氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷
DMEM，高糖	Thermo Fisher Scientific	12100046	粉末
DMSO	Sintorgan	SIN-061	二甲基亚砜
胎牛血清	Internegocios SA	FCS FRA 500	无菌且经热灭活
G418 硫酸盐溶液	Roche	G418-RO	储存浓度：50 mg/mL
葡萄糖 D(+)	Cicarelli	716214
量筒	Nalgene	3663-1000
血红素	Frontier Scientific	H651-9
KCl	Cicarelli	867212
肝脏浸出液	Difco	226920
1.5 mL 微量离心管	Tarson	500010-N
微孔板分光光度计	Biotek	Synergy HTX
Na2HPO4	Cicarelli	834214
NaCl	Cicarelli	750214
血细胞计数板	Boeco	BOE 01
Nonidet P-40	Antrace	NIDP40	2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇
Prism	Graphpad		统计分析软件
碳酸氢钠	Cicarelli	929211	NaHCO3
Sorvall ST 16 离心机	Thermo Fisher Scientific	75004380
T-25 培养瓶	Corning	430639
胰蛋白胨	Merck	1106760500
Vero 细胞	ATCC	CRL-1587