根据INAD蛋白复合物的组装机制，本方案采用改良的亲和纯化结合竞争策略，以纯化内源性的Drosophila TRP通道。
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本文内容
摘要
摘要
Drosophila 光转导是目前已知最快的G蛋白偶联信号通路之一。为了确保该信号级联的特异性和高效性，钙离子（Ca2+）可通透的阳离子通道——瞬态感受器电位（TRP）通道——与支架蛋白无后电位D（INAD）紧密结合，并与眼组织特异性的蛋白激酶C（ePKC）以及磷脂酶Cβ/无感受器电位A（PLCβ/NORPA）共同形成一个大型信号蛋白复合物。然而，Drosophila TRP通道的生化特性仍不明确。基于INAD蛋白复合物的组装机制，本研究建立了一种改进的亲和纯化结合竞争策略，用于纯化内源性TRP通道。首先，将纯化的带有组氨酸（His）标签的NORPA 863-1095片段结合至镍柱（Ni-beads），作为诱饵从Drosophila 头部匀浆中捕获内源性INAD蛋白复合物。随后，向镍柱中加入过量的纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签TRP 1261-1275片段，以竞争性置换TRP通道。最后，通过尺寸排阻色谱法将上清液中的TRP通道与过量的TRP 1261-1275肽段分离。该方法使得从生物化学和结构角度研究Drosophila TRP通道的门控机制成为可能。未来还可进一步检测纯化后的Drosophila TRP通道的电生理特性。
引言
光转导是一个将吸收的光子转化为神经元电信号的过程。该过程在脊椎动物和无脊椎动物中均特异性地依赖视蛋白及其下游的G蛋白偶联信号级联反应。在 果蝇， 通过其五个PDZ结构域，支架蛋白inactivation-no-after-potential D（INAD）组织形成一个包含瞬时受体电位（TRP）通道、磷脂酶Cβ/无受体电位A（PLCβ/NORPA）以及眼特异性蛋白激酶C（ePKC）的超分子信号复合物1该超分子信号复合物的形成确保了其正确的亚细胞定位、高效性及特异性 黑腹果蝇 光转导机制。在此复合物中，光敏感的TRP通道作为NORPA的下游效应器，介导钙离子内流和感光细胞的去极化。先前的研究表明，TRP通道的开放 黑腹果蝇 TRP通道由质子、局部脂质环境的破坏或机械力介导2,3,4。该 果蝇 TRP 通道也与钙调蛋白相互作用5 并通过正反馈和负反馈受钙的调节6,7,8.
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方案
1. GST标签TRP和His标签NORPA片段的纯化
- 纯化带有 GST 标签的 TRP 1261-1275 片段
- 转化 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 质粒10 进入 大肠杆菌（Escherichia coli） BL21 (DE3) 细胞采用 CaCl₂2 热激转化法21. 挑取单菌落接种于10 mL Luria Bertani（LB）培养基中，37℃过夜培养 °C. 然后，在37℃下将10 mL种子培养物扩增至1 L LB培养基中 °C.
- 在光密度（OD600) 细胞密度达到 0.5 时，将细胞冷却至 16 °C，并加入 0.1 mM 异丙基-β-硫代半乳糖苷 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG；终浓度）以诱导目标蛋白的过表达，并于16℃培养 °4 ℃孵育 18 小时。
- 过表达后，通过在 3,993 × g 离心收集 1 L 培养细胞菌体 × g 孵育20分钟，然后重悬于40 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 将重悬的细胞加入预冷至4℃的高压均质机中 °C. 缓慢将匀浆器压力升至 800 bar。打....
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结果
本文展示了一种蛋白质纯化方法，用于纯化内源性的Drosophila TRP通道（图1）。
首先，通过重组蛋白表达与纯化方法获得诱饵蛋白和竞争蛋白。随后，在LB培养基中于E. coli BL21 (DE3)细胞中表达带有GST标签的TRP 1261-1275片段，并利用谷胱甘肽磁珠及尺寸排阻柱进行纯化（图2）。样品通过考马斯亮蓝R250染色的SDS-PAGE分析进行验证。在SDS-PAGE样品制备过程中，将30 µL蛋白样品与10 µL 4x上样缓冲液混合，在100 °C下煮沸10分钟，然后将15 µL煮沸后的样品分别加入各加样孔中。带有His标签的NORPA 863-1095片段同样在LB培养基中的E. coli BL21 (DE3)细胞中表达，并通过Ni磁珠和尺寸排阻柱进行纯化（图3）。纯化后的GST标签TRP 1261-1275和His标签NORP.......
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讨论
INAD 含有五个 PDZ 结构域，是 Drosophila 光传导机制的核心组织者。先前的研究表明，INAD 的 PDZ3 结构域以极高的特异性结合 TRP 通道的 C 末端尾部（KD = 0.3 µM）18。INAD 的 PDZ45 串联结构域与 NORPA 的 863-1095 片段具有极强的结合亲和力（KD = 30 nM）。这些发现为设计亲和纯化结合竞争策略提供了坚实的生物化学基础，使得 NORPA 的 CC-PBM 片段可作为拉下实验的诱饵，而 TRP 的 C 末端尾部（片段 1261-1275）则作为竞争性试剂发挥作用。因此，该方法的第一个关键点在于理解 INAD 复合物的组装机制，并获得足量的 NORPA 和 TRP 片段。同时，由于 TRP 通道是一种膜蛋白，需要从膜中提取并在溶液中保持稳定，因此去垢剂的使用是该方法的第二个关键点。作为一种常用于 TRP 通道结构与功能研究的去垢剂24,25，正.......
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（No. 31870746）、深圳市基础研究计划（JCYJ20200109140414636）和中国广东省自然科学基金（No. 2021A1515010796）对 W. L. 的资助。我们感谢 LetPub（www.letpub.com）在本论文撰写过程中提供的语言学协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌菌株 | |||
| BL21(DE3) 感受态细胞 | Novagen | 69450 | 蛋白过表达 |
| 实验模型 | |||
| D.melanogaster: W1118 品系 | 布卢明顿果蝇资源中心 | BDSC:3605 | 果蝇头部制备 |
| 材料 | |||
| 20/30/40 目不锈钢筛网 | 九丰金属网公司 | GB/T6003.1 | 果蝇头部制备 |
| 30% 丙烯酰胺-N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（29:1） | Lablead | A3291 | SDS-PAGE 凝胶制备 |
| 过硫酸铵 | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE 凝胶制备 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 05892953001 | 蛋白酶抑制 |
| 考马斯亮蓝 R-250 | 生工生物 | A100472-0025 | SDS-PAGE 凝胶染色 |
| DL-二硫苏糖醇（DTT） | 生工生物 | A620058-0100 | 凝胶过滤层析缓冲液制备 |
| 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA） | 生工生物 | A500838-0500 | 凝胶过滤层析缓冲液制备 |
| 甘氨酸 | 生工生物 | A610235-0005 | SDS-PAGE 缓冲液制备 |
| 谷胱甘肽 Sepharose 4 快流速珠 | Cytiva | 17513202 | 亲和层析 |
| 咪唑 | 生工生物 | A500529-0001 | Ni柱洗脱缓冲液制备 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | 生工生物 | A600168-0025 | 蛋白过表达诱导 |
| LB 培养基粉末 | 生工生物 | A507002-0250 | 大肠杆菌细胞培养 |
| 还原型 L-谷胱甘肽（GSH） | Sigma-aldrich | G4251-100G | 谷胱甘肽珠洗脱缓冲液制备 |
| Ni-Sepharose excel 珠 | Cytiva | 17371202 | 亲和层析 |
| N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM） | 生工生物 | A610424-001 | 蛋白纯化用去垢剂 |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED） | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE 凝胶制备 |
| PBS | 生工生物 | E607008-0500 | 大肠杆菌细胞匀浆缓冲液 |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | 蛋白酶抑制 |
| 预染蛋白 Marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | 预染蛋白 ladder |
| 凝胶过滤层析柱（制备级） | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG 柱 |
| 凝胶过滤层析柱（分析级） | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL 柱 |
| 氯化钠 | 生工生物 | A501218-0001 | 蛋白纯化缓冲液制备 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | 生工生物 | A500228-0001 | SDS-PAGE 凝胶/缓冲液制备 |
| Tris 碱 | Sigma-aldrich | T1503-10KG | 蛋白纯化缓冲液制备 |
| 超滤离心管 | Millipore | UFC901096/801096 | 蛋白浓缩 |
| 设备 | |||
| 分析天平 | DENVER | APX-60 | 果蝇头部称重 |
| 适用于 15 mL 和 50 mL 锥形离心管的台式高速冷冻离心机 | Eppendorf | 5810R | 蛋白浓缩 |
| 适用于 1.5 mL 离心管的台式高速冷冻离心机 | Eppendorf | 5417R | 匀浆后果蝇头部裂解液离心 |
| 空重力流层析柱（内径=1.0 cm） | Bio-Rad | 738-0015 | TRP 蛋白纯化 |
| 空重力流层析柱（内径=2.5 cm） | Bio-Rad | 738-0017 | 从大肠杆菌中纯化诱饵蛋白和竞争蛋白 |
| 凝胶成像系统 | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR 系统 | SDS-PAGE 成像 |
| 高速冷冻离心机 | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | 大肠杆菌细胞/细胞裂解液离心 |
| 高压均质机 | UNION-BIOTECH | UH-05 | 大肠杆菌细胞匀浆 |
| 液氮罐 | Taylor-Wharton | CX-100 | 果蝇头部制备 |
| 蛋白纯化系统 | Cytiva | AKTA purifier | 蛋白纯化 |
| 冰箱（-80°C） | Thermo | 900GP | 果蝇头部制备 |
| 分光光度计 | MAPADA | UV-1200 | 大肠杆菌细胞 OD600 测定 |
| 分光光度计 | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | 蛋白浓度测定 |
| 超速离心机 | Beckman coulter | Optima XPN-100 超速离心机 | 超速离心 |
参考文献
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by proto....
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