يصف هذا البروتوكول التصوير الفلوري وتحليل الإنزيمات المساعدة الأيضية الذاتية المنشأ، وانخفاض نيكوتيناميد الأدينين (الفوسفات) ثنائي النوكليوتيد (NAD(P)H)، وثنائي النوكليوتيد المؤكسد فلافين الأدينين (FAD). يوفر التصوير الفلوري الذاتي ل NAD (P) H و FAD طريقة خالية من الملصقات وغير مدمرة لتقييم التمثيل الغذائي الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الفلوري الذاتي لتقييم التمثيل الغذائي الخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأيض الخلوي هو العملية التي تولد بها الخلايا الطاقة ، وتتميز العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان ، بالتمثيل الغذائي غير الطبيعي. انخفاض نيكوتيناميد الأدينين (الفوسفات) ثنائي النوكليوتيد (NAD (P) H) و الفلافين المؤكسد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD) هي إنزيمات مساعدة للتفاعلات الأيضية. يظهر NAD (P) H و FAD تألقا ذاتيا ويمكن عزلهما طيفا عن طريق الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات. يمكن أن يوجد كل من الإنزيمات المساعدة ، NAD (P) H و FAD ، إما في تكوين حر أو مرتبط بالبروتين ، ولكل منهما عمر فلوري متميز - وهو الوقت الذي يبقى فيه الفلوروفور في حالة الحماس. يسمح التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) بتحديد كمية كثافة التألق وعمر NAD (P) H و FAD لتحليل التمثيل الغذائي الخلوي بدون ملصقات. يمكن تحسين كثافة التألق والمجاهر مدى الحياة لتصوير NAD (P) H و FAD عن طريق اختيار الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاثات. تتحقق الاضطرابات الأيضية بواسطة السيانيد من بروتوكولات التصوير الفلوري الذاتي للكشف عن التغيرات الأيضية داخل الخلايا. ستوضح هذه المقالة تقنية التصوير الفلوري الذاتي ل NAD (P) H و FAD لقياس التمثيل الغذائي الخلوي.
المقدمة
الأيض هو العملية الخلوية لإنتاج الطاقة. يشمل التمثيل الغذائي الخلوي مسارات متعددة ، بما في ذلك تحلل السكر ، والفسفرة التأكسدية ، وتحلل الجلوتامين. تستخدم الخلايا السليمة هذه المسارات الأيضية لتوليد الطاقة من أجل الانتشار والوظيفة ، مثل إنتاج السيتوكينات بواسطة الخلايا المناعية. تتميز العديد من الأمراض، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية والسرطان والتنكس العصبي، بتغيير التمثيل الغذائي الخلوي1. على سبيل المثال ، تحتوي بعض أنواع الخلايا السرطانية على معدلات مرتفعة من تحلل السكر ، حتى في وجود الأكسجين ، لتوليد جزيئات لتخليق الأحماض النووية والبروتينات والدهون2,3. هذه الظاهرة، المعروفة باسم تأثير....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. طلاء الخلايا للتصوير
- استنشق الوسط من قارورة T-75 المتقاربة بنسبة 80-90٪ من خلايا MCF-7 ، واشطف الخلايا ب 10 مل من المياه المالحة المعقمة العازلة بالفوسفات (PBS) ، وأضف 2 مل من 0.25٪ من التربسين (1x) لفصل الخلايا عن قاع القارورة.
- احتضن القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق تقريبا. تحقق من الخلايا تحت المجهر لتأكيد الانفصال.
- أضف على الفور 8 مل من وسط الثقافة لإلغاء تنشيط التربسين.
- جمع الخلايا في أنبوب مخروطي (15 مل أو 50 مل). عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
- الطرد المركزي للخلايا 200 × غرام لمدة 5 دقائق.
- بمجرد الطرد المركزي ، استنشق السوبرناتان. أعد تعليق حبيبات الخلايا في 1 مل من ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استزراع خط خلايا سرطان الثدي الظهاري ، MCF-7 ، في DMEM مع استكمال 10 ٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين. بالنسبة للتصوير الفلوري ، تم زرع الخلايا بكثافة 4 × 105 خلية لكل طبق تصوير 35 مم من الزجاج السفلي قبل 48 ساعة من التصوير. تم تصوير الخلايا قبل وبعد العلاج بالسيانيد باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه. الهدف من تجربة السيانيد هو تأكيد العزل الطيفي ل NAD (P) H و FAD الفلورية والتحقق من صحة نظام التصوير وبروتوكول التحليل للكشف عن التغيرات الأيضية في الخلايا. تم التقاط صور مقترنة بعمر .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم استخدام كثافة التألق الذاتي والتصوير مدى الحياة على نطاق واسع لتقييم التمثيل الغذائي في الخلايا21,55. FLIM عالي الدقة وبالتالي يحل الخلايا المفردة ، وهو أمر مهم لدراسات السرطان لأن عدم التجانس الخلوي يساهم في عدوان الورم ومقاومة الأدوية7,39,41,44,45,46,58.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تشمل مصادر التمويل معهد الوقاية من السرطان وأبحاثه في تكساس (CPRIT RP200668) وجامعة تكساس إيه آند إم. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-ديوكسي-د-جلوكوز (2-DG) | سيجما | AC111980000; AC111980010. AC111980050. AC111980250 | |
| مضاد حيوي مضاد للميكروبات (القلم العقدي) | عينات الخلايا 15240096 | ||
| مجموعة | ثقافة النوع الأمريكي | N / A | MCF-7 خط السرطان |
| CellProfiler | Broad Institute | N / A | برنامج تحليل الصور |
| أنبوب مخروطي | VWR | 89039-664 | 15 مل أنبوب مخروطي |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | وسائل الإعلام ثقافة |
| FAD مرآة ثنائية اللون | Semrock | FF495-Di03-25x36 | 495 نانومتر |
| مرشح انبعاث FAD | Semrock | FF01-550 / 88-25 | 550/88 نانومتر |
| مرشح الإثارة FAD | Semrock | FF01-458 / 64-25 | 458/64 نانومتر |
| FBS | ThermoFisher | 16000036 | |
| مجهر تألق مدى الحياة | 3i | N / A | |
| طبق زجاجي قاع | MatTek Corp | P35G-1.0-14-C | |
| ليزر متعدد الفوتون | متماسك | N / A | 2P ليزر متماسك ، قابل للضبط 680 نانومتر -1080 نانومتر |
| NAD (P) H مرآة ثنائية اللون | Semrock | FF409-Di03-25x36 | 409 نانومتر |
| NAD (P) H مرشح انبعاث | Semrock | FF02-447 / 60-25 | 447/60 نانومتر |
| NAD (P) H مرشح الإثارة | Semrock | FF01-357 / 44-25 | 357/44 نانومتر |
| PBS | ThermoFisher | 70011044 | |
| سيانيد البوتاسيوم | سيجما ألدريتش | 380970 | |
| SlideBooks 6 | 3i | N / A | برنامج الحصول على الصور |
| SPCImage | Becker & Hickl GmbH | N / A | برنامج تحليل العمر المضان |
| المرحلة الأعلى حاضنة | okoLab | N / A | |
| Trypsin | Biosciences | 786-262 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| YG peads | Polysciences | 19096-2 | Yg microspheres (20.0 & micro; م) |
المراجع
- Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
- Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using en....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
