Здесь мы представляем воспроизводимый протокол электропорации in vitro для генетических манипуляций с первичными предшественниками клеток гранул мозжечка (GCP), который является экономически эффективным, эффективным и жизнеспособным. Кроме того, этот протокол также демонстрирует простой метод молекулярного исследования первичных реснечно-зависимых сигнальных путей Hedgehog в первичных клетках GCP.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичная ресничка является критической сигнальной органеллой, обнаруженной почти на каждой клетке, которая преобразует сигнальные стимулы Hedgehog (Hh) с поверхности клетки. В предшественнике гранулярной клетки (GCP) первичная ресничка действует как ключевой сигнальный центр, который организует пролиферацию клеток-предшественников, модулируя сигнальный путь Hh. Исследование первичного ресничково-зависимого сигнального механизма Hh облегчается генетическими манипуляциями in vitro с компонентами пути для визуализации их динамической локализации в первичной ресничке. Однако трансфекция трансгенов в первичных культурах ГКП с использованием известных в настоящее время методов электропорации, как правило, является дорогостоящей и часто приводит к низкой жизнеспособности клеток и нежелательной эффективности трансфекции. В этой статье представлен эффективный, экономичный и простой протокол электропорации, который демонстрирует высокую эффективность трансфекции ~ 80-90% и оптимальную жизнеспособность ячейки. Это простой, воспроизводимый и эффективный метод генетической модификации, который применим к изучению первичного ресничковозависимого сигнального пути ежа в первичных культурах GCP.
Введение
Мозжечковые GCP широко используются для изучения механизма сигнального пути Hh в нейронных типах клеток-предшественников из-за их высокой распространенности и высокой чувствительности к сигнальному пути Hh in vivo1,2,3,4. В GCP первичная ресничка действует как ключевой сигнальный узел трансдукции Hh5, который управляет пролиферацией клеток-предшественников6,7,8. Визуализация in vitro сигнальных компонентов H....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры, связанные с животными, были выполнены в соответствии с руководящими принципами обращения с животными и протоколом, утвержденным Департаментом здравоохранения Гонконга. Лицензии на эксперименты на животных в соответствии с Постановлением о контроле за экспериментами на животных (глава 340) были получены от Министерства здравоохранения правительства Гонконга. Работа с животными проводилась в соответствии с этикой безопасности животных, утвержденной Исследовательским офисом HKBU и Комитетом по безопасности лабораторий. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя Opti-MEM (см. Таблицу материалов) в качестве универсального реагента, эта предлагаемая методология электропорации может достичь стабильно высокой эффективности электропорации при ~80-90% (рисунок 1). Эффективность электропорации вектора Smo-EGFP определяли при DIV 2 после электропорации путем количественной оценки процента зеленых флуоресцентно-положительных клеток во всех парных бокс-белках-6 (Pax6)-экспрессирующих GCP-клетках. Эффективность электропорации групп, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Трансфекция трансгенов в первичной культуре GCP методом электропорации обычно связана с низкой жизнеспособностью клеток и плохой эффективностью трансфекции9,10. В настоящем документе представлен экономически эффективный и воспроизводимый протокол электропорации, который продемонстрировал высокую эффективность и жизнеспособность. Кроме того, мы также демонстрируем простой метод изучения первичного ресничковозависимого сигнального пути Hh в первичных клетках GCP.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Это исследование было поддержано Посевным фондом HKBU и грантом tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Советом по исследовательским грантам-Фондом совместных исследований (CRF-C2103-20GF) для C.H.H. Hor.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| GCP Culture | |||
| B27 добавка | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Клеточный фильтр, 70 &; m | Corning | 352350 | |
| DNase I из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Roche | 11284932001 | |
| Earle' s Сбалансированный солевой раствор | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, сертифицированный | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I, 100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | заменитель L-глутамина |
| L-цистеин | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Матрица базальной мембраны |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain, суспензия | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| поли-D-лизина гидробромид | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Разглаженный агонист |
| <сильно>IF окрашивание | |||
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Параформальдегид | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 Sigma | Aldrich | X100 | |
| Первичная смесь антител | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Фактор разведения: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b мышиный моноклональный ab | NeuroMab | 75-287 | Фактор разведения: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 кролик поликлональный ab | Covance | PRB-278P | Коэффициент разведения: 1 : 1000 |
| <сильный>Смесь вторичных антител | |||
| Alexa Fluor 488 ослик антикозий IgG | Invitrogen | A-11055 | Фактор разведения: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 осёл против мышей IgG | Invitrogen | A-31570 | Коэффициент разведения: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 осёл против кролика IgG | Invitrogen | A-31573 | Коэффициент разведения: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Коэффициент разбавления: 1 : 1000 |
| <сильный>Электропорация | |||
| CU 500 кюветная камера | Nepagene | CU500 | |
| EPA Электропорационная кювета (зазор 2 мм) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | среда с пониженным содержанием сыворотки для трансфекции |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Супер Электропоратор NEPA21 ТИП II In vitro и in vivo Электропорация | Nepagene | NEPA21 |
Ссылки
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
