猪外周血来源的血液出芽内皮细胞（BOEC）的表征

摘要

内皮是一类动态的整合性结构，在血管生成、止血、炎症反应和稳态等多种生理功能中发挥重要作用。内皮还在动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等病理生理过程中起关键作用。内皮细胞构成血液和淋巴管的内层衬里，并在结构和功能上表现出异质性。多个研究团队已评估了来源于人外周血的内皮细胞功能，重点关注由造血干细胞衍生的内皮祖细胞或成熟血液来源的内皮细胞（即内皮集落形成细胞）。这些细胞可作为自体治疗和疾病建模的资源。异种细胞由于来源丰富且可通过在相似条件下饲养遗传背景相近的动物获得较高同质性，可能成为治疗用细胞的替代来源。因此，本文提出了一种从猪外周血中有效分离和扩增高增殖性血液来源内皮细胞的稳健方案。这些细胞可用于多种应用，包括心血管组织工程、细胞治疗、疾病建模、药物筛选、内皮细胞生物学研究，以及用于研究异种移植中炎症和凝血反应的体外共培养体系。

引言

内皮是一类高度复杂且动态的结构，是血管壁的重要组成部分。它衬在血管内表面，为循环血液与周围组织之间提供一个物理界面。这种异质性结构具有多种功能，包括血管生成、炎症反应、血管调节以及止血功能^1,2,3,4。人脐静脉内皮细胞是研究内皮细胞功能的常用细胞类型。然而，由于存在患者特异性的批次差异、表型不一致以及较低的传代效率，提示有必要寻找一种能够改善上述所有特性的细胞来源⁵。

获得均一的原代内皮细胞群体在技术上具有挑战性，且原代内皮细胞的增殖能力较低⁶。 因此，为了研究血管再生并评估病理生理过程，多个研究团队已尝试获取和评估来源于外周血的不同类型内皮细胞，例如内皮祖细胞（EPCs）或血液来源的内皮细胞（BOECs）^6,7,8,9。纺锤形的早期EPCs来源于造血干细胞（HS....

方案

所有动物实验均获得威斯康星医学院和梅奥诊所各自的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

注意：本研究使用约克夏/长白/杜洛克杂交家猪（Sus domesticus），雌雄均有，体重40-80 kg，年龄3-6个月。

1. 收集猪外周血

1. 准备材料。
   1. 将肝素溶液用无菌生理盐水稀释至 100 U/mL。
   2. 向两个 50 mL 锥形管和两个 60 mL 注射器中各加入 3–4 mL 肝素溶液。
   3. 将未稀释的肝素溶液（1,000 U/mL）抽入一段延长管中。
   4. 将 19 G 针头连接至装有肝素的延长管一端，另一端连接含肝素的 60 mL 注射器。
2. 根据机构规定对猪进行麻醉。
   1. 通过肌内注射给予阿托品（0.05 mg/kg）、替来他明/唑拉西泮（2–5 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）以诱导麻醉。
      注意：当动物失去意识且下颌肌肉松弛时，表明已达到充分麻醉状态。
   2. 将动物仰卧位放置，并在两侧放置卷起的毛巾以提供稳定性。
   3. 在眼睛上涂抹眼用软膏，防止麻醉期间角膜干燥。
   4. 在麻醉期间提供保温支持，包括毛毯、加热垫和/或加热手术....

结果

从细胞培养开始直至观察到BOEC集落，持续观察了培养细胞的形态（图1）。一小部分贴壁细胞开始附着于培养皿并生长，而非贴壁细胞则通过更换培养基被去除（图1B）。集落最早在第6天出现，表现为一群类似内皮细胞的细胞从中心点向外呈放射状增殖（图1D）。随着培养的进行，细胞集落逐渐变得更加致密，并呈现出类似于成熟内皮细胞的鹅卵石样形态（图1F）。典型的内皮细胞鹅卵石样形态可通过光学显微镜对BOEC进行简便的初步鉴定。

内皮细胞集落通常在培养10至14天后即可进行传代。此时，6孔板通常可获得约100万个细胞，细胞活力百分比为93%–98%。在首次传代过程中，内皮细胞在T75培养瓶中扩增后可获得约600万至1000万个细胞。

为评估BOECs的形态发生过程，将基底膜基质（例如Matrigel）以每孔10 .......

讨论

BOECs 是一种强大的工具，可用于多种科学研究和治疗策略^7,8,16。BOECs 已被用于分析内皮细胞（EC）基因表达，以阐明导致血管疾病和癌症发生的关键因素^5,19,20,21。BOECs 还已被应用于血管再生和基因递送等治疗领域^22,23,24。经基因修饰的 BOECs 已被证实具有抗血管生成的肿瘤治疗能力^25,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
19 G 针头	Covidien	1188818112
50 mL 锥形管	Corning	352098
6 孔板	BD Falcon	353046
60 mL 注射器	Covidien	8881560125
氯化铵溶液（0.8%）	Stemcell Technologies	07850
抗生素/抗真菌素溶液（100 倍浓度）	Gibco	15240-062
离心机	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 培养基	Lonza Walkersville	CC-3162
延长管	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
胎牛血清（FBS）	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	密度梯度溶液
肝素钠注射液（1,000 单位/mL）	Pfizer	00069-0058-01
人血浆纤连蛋白	Gibco	33016-015
冰	N/A	N/A
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023
移液器套装	Eppendorf	2231300004
无菌水	Gibco	15230-162
细移液管	Celltreat Scientific	229280