본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 초기 췌장 발달을 연구하고 당뇨병의 유전 적 기여자를 조사하기위한 훌륭한 도구입니다. hPSC 유래 인슐린 분비 세포는 세포 치료 및 질병 모델링을 위해 생성될 수 있지만, 제한된 효율성 및 기능적 특성을 갖는다. 베타 세포 및 기타 내분비 세포의 전구체인 hPSC 유래 췌장 전구세포는 두 전사 인자 PDX1 및 NKX6.1을 동시 발현할 때 시험관 내 및 생체 내 모두에서 기능적인 인슐린 분비 베타 세포에 대한 전구세포를 지정합니다. hPSC 유래 췌장 전구 세포는 현재 임상 시험의 일환으로 제1형 당뇨병 환자의 세포 치료에 사용됩니다. 그러나 현재의 절차는 NKX6.1 및 췌장 전구 세포의 높은 비율을 생성하지 않아 비 기능성 내분비 세포의 공동 생성과 포도당 반응성, 인슐린 분비 세포가 거의 없습니다. 따라서 이 연구는 2D 단층에서 PDX1과 NKX6.1의 동시 발현을 최대화하는 hPSC 유래 췌장 전구세포를 생성하기 위한 향상된 프로토콜을 개발했습니다. 세포 밀도, 신선한 기질의 가용성 및 hPSC 유래 내배엽 세포의 해리와 같은 요인이 조절되어 생성된 췌장 전구 세포에서 PDX1 및 NKX6.1 수준을 증가시키고 대체 간 계통에 대한 헌신을 최소화합니다. 이 연구는 시험관 내 분화 중에 세포의 물리적 환경을 조작하는 것이 계통 사양 및 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있음을 강조합니다. 따라서, 현재 최적화된 프로토콜은 세포 치료 및 질병 모델링을 위한 PDX1 및 NKX6.1 공동-발현 전구세포의 스케일러블한 생성을 용이하게 한다.
서론
당뇨병은 전 세계적으로 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 복잡한 대사 장애입니다. 인슐린 보충은 당뇨병의 유일한 치료 옵션으로 간주됩니다. 더 진행된 경우는 전체 사체 췌장 또는 섬 1,2의 이식을 통해 달성되는 베타 세포 대체 요법으로 치료됩니다. 이식 요법을 둘러싼 몇 가지 문제, 예를 들어 조직의 가용성 및 질에 대한 제한, 면역 억제제에 대한 지속적인 필요성 외에도 이식 절차의 침습성. 이를 위해서는 베타 세포 대체 요법 2,3에 대한 새롭고 대안적인 옵션을 발견 할 필요가 있습니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 최근 인간 췌장 생물학을 이해하기위한 유망한 도구로 부상했으며 이식 요법 4,5,6,7을위한 완전하지 않고 잠재적으로 개인화 된 소스로 부상했습니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정안 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC (no. 16260/16) 및 카타르 생물 의학 연구소 (QBRI) (no. 2016-003)의 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1, H9 및 HUES8과 같은 hESC에 최적화되어 있습니다. 혈액 샘플은 충분한 정보에 입각 한 동의하에 Hamad Medical Corporation (HMC) 병원의 건강한 개인으로부터 얻었습니다. iPSCs는 대조군, 건강한 개체23의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 생성된다.
1. 배양배지의 제조
- 인간 만능줄기세포(hPSC) 배양액 준비
- 100 units/mL의 페니실린과 100ug/mL의 스트렙토마이신을 보충하여 인간 배아 줄기 세포를 유지 및 확장하기 위해 시판되는 배지에서 hPSC 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조). 전체 매체를 분취하여 장기간 -20°C 또는 즉시 사용을 위해 4°C에서 보관합니다.
- 1....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
결과는 최적화된 프로토콜 P2-D(그림 1A)가 PDX1 및 NKX6.1 동시 발현을 상향조절하여 췌장 전구체 분화 효율성을 향상시켰음을 보여줍니다(그림 2A, B 및 그림 3A). 특히, 결과는 내배엽 세포의 해리와 새로운 막 기질에서의 재 도금이 이전에 발표 된 연구에서 수정 된 비 해리 프로토콜 (P1-ND)과 비교하여 hPSC 유래 췌장 전구 세포 (최적화 된 프로토콜, P2-D)에서 3 단계 NKX6.1 발현을 향상 시켰음을 보여주었습니다(그림 2 및 그림 3A) . 본 강화된 프로토콜은 또한 "P1-D"(프로토콜 1, S3 = 2일, 해리됨) 및 "P2.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 연구는 PDX1 및 NKX6.1의 높은 공동 발현을 갖는 hPSC로부터 췌장 전구 세포를 생성하기위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 신선한 매트릭스에서 절반 밀도에서 hPSC 유래 내배엽의 해리 및 재 도금은 hPSC 유래 췌장 전구 세포에서 더 높은 PDX1 및 NKX6.1을 초래했습니다.
각 단계에 대한 성장 인자 칵테일은 P1-ND 27과 매우 유사하지만, FGF 및 레티노이드 신호 전달 및 BMP 및 고슴도치 억제를 포함한보다 확장 된 3 단계 처리가 NKX6.1 발현을 증가시키는 것으로 나타 났으며, 이는 Nostro et al.의 연구 결과27과 대조된다. 배아 발달 동안 췌장에서의 PDX1 발현은 FGF 및 레티노이드 신호 전달 및 BMP 및 고슴도치 억제27,29,30에 의해 긍정적으로 조절되는 반면
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호. NPRP10-1221-160041).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL, 원뿔형, 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24웰 배양 플레이트, 평평한 바닥(뚜껑 포함 | Costar | 3524 | |
| 50 mL, 원추형, 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6웰 배양 플레이트, 다양한 용도 | Thermo Scientific | ||
| Accutase | 줄기 세포 기술 | 0-7920 | |
| Activin A | R & D | 338-AC | 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 항체, 마우스 단클론 | DSHB | F55A12-C | 유세포 분석을 위해 1:100으로, 면역 염색 항 PDX1 항체를 위해 1:2000으로 희석 |
| 기니피그 다클론 | Abcam | ab47308 | 유세포 분석을 위해 1:100으로, 면역 염색 B27을 위해 1:100에서 |
| Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| 소 혈청 알부민, 열 충격 분율, 지방산 무함유 | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | DMSO |
| DMEM | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L) 고도로 교차 흡착 된 2 차 항체, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | 0.1 % BSA로 재구성; |
| D | 345-FG | PBS | |
| 포도 | 시그마 Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | 시그마 | 23491-45-4 | |
| 도립 현미경 | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR 혈청 교체 | Gibco | 10828-028 | |
| L-아스코르브산(비타민 C) | 시그마 | A92902 | 증류수에서 재구성 |
| 마트리겔 성장 인자 감소(GFR) 기저막 매트릭스 | 코닝 | 354230 | 해동 원료를 분취하고 -20°C에서 동결합니다. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | 유세포 분석을 위해 1:100으로 희석하고 면역염색을 위해 1:2000으로 희석됨 |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | 기초 배지를 보충제와 혼합합니다. 부분 표본 및 -20 °에 저장; C 더 긴 시간 또는 4 ° 즉시 사용을 위한 C |
| Nalgene 필터 장치, 0.2 &마이크로; m PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| 니코틴아미드 | 시그마 | 72340 | 증류수 |
| NOGGIN | R&에서 재구성 D | 6057-NG | 4%에서 0.1% BSA로 재구성 |
| ChemCruz | sc-281692 | ||
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 휴대용 진공 흡입기 | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | 세포 신호 전달 기술 | 3143 | 유세포 분석의 경우 1:100, 1:500으로 희석 면역 염색 |
| 레티노산 | 시그마 알드리치 | R2625 | DMSO |
| 암석 억제제(Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | |
| DMSO 원형 바닥 폴리스티렌 FACS 튜브에서 재구성 캡, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | 시그마 알드리치 | S4572 | DMSO |
| 나트륨으로 재구성 중탄산염 | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | 기초 배지를 보충제와 혼합합니다. 부분 표본 및 -20 °에 저장; C 더 긴 시간 또는 4 ° 즉시 사용을 위한 C |
| TALI 세포 분석 슬라이드 | Invitrogen | T10794 | |
| Tali 이미지 기반 세포 분석기 자동 세포 계수기 | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | 인비트로젠 | 15575-038 |
참고문헌
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
