يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور وقياس حلقات الأكتين والمكونات الأخرى للهيكل العظمي الدوري للغشاء للجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام الخلايا العصبية الحصينية للفئران المستزرعة ومجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس خصائص الهيكل العظمي الدوري للغشاء للجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام مجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجزء الأولي للمحور العصبي (AIS) هو الموقع الذي تبدأ فيه إمكانات العمل ويشكل مرشحا للنقل وحاجزا للانتشار يساهم في الحفاظ على قطبية الخلايا العصبية عن طريق فرز البضائع الجسدية الشجيرية. يوفر الهيكل العظمي الدوري الغشائي (MPS) الذي يتكون من حلقات أكتين دورية سقالة لتثبيت بروتينات AIS المختلفة ، بما في ذلك البروتينات الهيكلية والقنوات الأيونية المختلفة. على الرغم من أن النهج البروتينية الحديثة قد حددت عددا كبيرا من مكونات AIS الجديدة ، إلا أن تفاصيل هيكل MPS وأدوار مكوناته الفردية غير موجودة. تتطلب المسافة بين حلقات الأكتين الفردية في MPS (~ 190 نانومتر) استخدام تقنيات الفحص المجهري فائق الدقة لحل التفاصيل الهيكلية ل MPS. يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخدام الخلايا العصبية الحصينية الفئران المستزرعة لفحص التوطين الدقيق لبروتين AIS في MPS بالنسبة لحلقات الأكتين الغشائية الفرعية باستخدام مجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM). بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف نهج تحليلي لتقييم دورية المكونات الفردية وموقعها بالنسبة لحلقات الأكتين كميا.
المقدمة
الجزء الأولي للمحور العصبي (AIS) هو منطقة قصيرة ومتخصصة بشكل فريد من المحور العصبي القريب من الخلايا العصبية الفقارية1. يتكون AIS من مرشح نقل وحاجز انتشار ضروري للحفاظ على قطبية الخلايا العصبية عن طريق فرز البضائع الجسدية المتغصنة2،3،4،5،6،7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الهيكل الفريد لنظام AIS يسمح له باستيعاب مجموعات من القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد التي تسهل وظيفته كموقع لبدء العمل المحتمل 8. يكمن المجمع الهيكلي المستقر للغ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم حصاد الخلايا العصبية الأولية للحصين المستخدمة في هذه التجارب16 من اليوم الجنيني 17 أجنة الفئران Wistar من أي من الجنسين بموجب المبادئ التوجيهية الأخلاقية لجامعة هلسنكي والقانون الفنلندي.
1. إعداد العينات
- على الأغطية الزجاجية عالية الدقة ، اسمح للخلايا العصبية الحصين الفئران بالنمو في ظروف زراعة متفرقة (~ 5000-10000 خلية / سم 2) لمدة 14 يوما (14 يوما في المختبر).
ملاحظة: استخدام الثقافات المتناثرة يقلل من فرص تداخل الخلايا العصبية ، مما يساعد على تحديد MPS. - إصلاح الخلايا العصبية باستخدام 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغطاء مرة واحدة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام الخلايا العصبية الحصين الفئران المستزرعة و 3D-SIM ، يتم وصف بروتوكول لتصور وقياس حلقات الأكتين والمكونات الأخرى ل MPS في AIS. أظهرت عمليات إعادة بناء مكدسات الصور دورية واضحة لحلقات الأكتين (الشكل 2 أ). في أيدينا ، كان متوسط المسافة بين الذروة لحلقات الأكتين في MPS ، التي تم تصورها باستخدام الفولويدين الموسوم ب Alexa 488 ، 190.36 ± 1.7 نانومتر (متوسط ± SEM). هذا يتماشى مع متوسط المسافة المبلغ عنه سابقا من ~ 190 نانومتر بين حلقات الأكتين في MPS. وبالمثل ، تم استخدام جسم مضاد مضاد ل a.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر البروتوكول الموضح هنا طريقة لتصور وقياس بروتينات MPS باستخدام تقنية الدقة الفائقة. نظرا لأن حلقات الأكتين ومكونات MPS الأخرى تعرض دورية تبلغ ~ 190 نانومتر 9,10 ، فإن أساليب التصوير التقليدية المحدودة الحيود لا يمكنها الكشف عن تفاصيل MPS. قد تعمل العديد من إعدادات الفحص المجهري على حل الهياكل المحدودة للحيود بدقة فائقة ، وتمثل بطاقة SIM خيارا قويا وغير معقد. الأهم من ذلك ، أن بطاقة SIM متوافقة مع الفلوروفورات الأكثر استخداما على نطاق واسع ، مما يوفر مرونة كبي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم الاعتراف بالدكتورة بيرتا هوتولينن لتعليقاتها النقدية ، التي لا تقدر بثمن لإعداد هذه المخطوطة. تم الاعتراف بالدكتورة ريمانتي مينكيفيتشيين لمساعدتها في إعداد الثقافات العصبية المستخدمة في التجارب الأصلية. تم إجراء جميع عمليات التصوير في وحدة التصوير Biomedicum. تم دعم هذا العمل من قبل أكاديمية فنلندا (D.M. ، SA 266351) وبرنامج الدكتوراه Brain & Mind (A.A.)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 24 لوحة بئر | Corning | 3524 | |
| 4٪ بارافورمالديهايد | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 المضاد للفأر | ThermoFisher | A31571 | |
| الأجسام المضادة ل Ankyrin G | UC Davis / NIH NeuroMab Facility ، استنساخ 106/36 | 75-146 | |
| الأجسام المضادة ل MAP2 | ميرك ميليبور | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE الرعاية الصحية علوم الحياة | N / A | |
| حزمة برامج فيجي | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| عالية الأداء Coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| آلة حاسبة زيت الغمر | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| الوسائط العصبية | القاعدية Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold تصاعد وسائل الإعلام | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 & micro ؛ م | ثيرموفيشر | T7279 | |
| تريتون-إكس | سيجما | X100 |
المراجع
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
