Настоящий протокол описывает интрацеребровентрикулярную (ICV) инъекцию взрослым рыбкам данио нейротоксического 6-гидроксидофамина (6-OHDA) в вентральный диэнцефалон (Dn) и оценку нарушения и последующее восстановление плавательного поведения после этого с использованием теста в открытом резервуаре, который сопровождается анализом с использованием программного обеспечения для отслеживания видео.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Локомоторная оценка 6-гидроксидофамин-индуцированной модели болезни Паркинсона у взрослых рыбок данио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ограничения современных методов лечения в задержке дофаминергической потери нейронов при болезни Паркинсона (БП) повышают потребность в альтернативных методах лечения, которые могут восстановить эти нейроны. В настоящее время много усилий направлено на лучшее понимание нейрорегенерации с использованием доклинических моделей in vivo . Однако эта регенеративная способность к самовосстановлению неэффективна у млекопитающих. Таким образом, животные, не являющиеся млекопитающими, такие как рыбки данио, стали отличной нейрорегенеративной моделью из-за ее способности постоянно самообновляться и иметь близкую гомологию мозга к людям. В рамках усилий по выяснению клеточных событий, участвующих в нейрорегенерации in vivo, мы создали модель БП взрослых рыбок данио, индуцированную 6-гидроксидотамином (6-OHDA). Это было достигнуто за счет оптимизированной интрацеребровентрикулярной (ICV) микроинъекции 99,96 мМ 6-OHDA для специфического абляции дофаминергических нейронов (DpN) в вентральном диэнцефалоне (Dn) мозга рыбок данио. Иммунофлуоресценция показала более 85% абляции DpN на третий день после поражения и полное восстановление DpN на участке поражения через 30 дней после поражения. Настоящее исследование определило ухудшение и последующее восстановление плавательного поведения рыбок данио после поражения с помощью теста в открытом поле, с помощью которого были количественно определены два параметра, пройденное расстояние (см) и средняя скорость (см/с). Локомоцию оценивали путем анализа записей отдельных рыб каждой группы (n = 6) с использованием программного обеспечения для отслеживания видео. Результаты показали значительное (p < 0,0001) снижение скорости (см / с) и пройденного расстояния (см) пораженных рыбок данио через 3 дня по сравнению с фикцией. Пораженная рыбка данио продемонстрировала полное восстановление плавательного поведения через 30 дней после высадки. Представленные результаты показывают, что 6-OHDA пораженная взрослая рыбка данио является отличной моделью с воспроизводимым качеством для облегчения изучения нейрорегенерации при БП. Будущие исследования механизмов, лежащих в основе нейрорегенерации, а также внутренних и внешних факторов, которые модулируют процесс, могут дать важное представление о новых стратегиях клеточной заместительной терапии против БП.
Введение
Болезнь Паркинсона (БП), заболевание, характеризующееся мышечной ригидностью, тремором покоя и брадикинезией, является самым быстрорастущим неврологическим заболеванием в мире1,2. Риск и распространенность БП быстро увеличиваются с возрастом, особенно у лиц в возрасте 50 лет и старше3. Этиология и патогенез БП до сих пор остаются малоизученными. Это часто оставляло раннее начало БП недиагностированным. В настоящее время недостаток дофамина и потеря дофаминергических нейронов (DpN) у пациентов с БП тесно связаны с проявлением двигательной симптоматики4. Используя ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Настоящее исследование было одобрено Комитетом по исследованиям и этике животных (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Ссылка No: UiTM CARE 346/2021 от 7 мая 2021 года].
ПРИМЕЧАНИЕ: Были использованы опубликованные протоколы22,25,26 для стандартного разведения и поддержания модели 6-OHDA-пораженных взрослых рыбок данио. Эксперименты проводились со взрослым самцом рыбки данио (Danio rerio) в возрасте более пяти месяцев со стандартизированной длиной 3,2-3,7 см.
1. Препараты для содержания рыбок данио и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В настоящем эксперименте оценивались изменения в плавательном поведении взрослых рыбок данио после микроинъекции ICV с 6-OHDA. Причина использования 6-OHDA в качестве нейротоксина выбора была связана с его неспособностью пересекать гематоэнцефалический барьер, который производил специфическую и целенаправленную абляцию DpN в области интереса - вентральный диэнцефалон (Dn)16. Субпопуляция DpN здесь имеет анатомическое сходство с субпопуляцией DpN в черной субстанции человека pars .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящая работа успешно продемонстрировала локомоторную оценку установленной 6-OHDA-индуцированной, взрослой модели PD на основе рыбок данио. Весь эксперимент включал в себя три основных этапа: подготовка микроинъекции до ICV, микроинъекция ICV рыбок данио и оценка локомоторов. Чтобы обеспечить здоровое восстановление взрослых рыбок данио после процедуры микроинъекции ICV и хороший экспериментальный результат, в настоящем исследовании были рекомендованы некоторые хорошие практики для каждого этапа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Министерством высшего образования Малайзии в рамках Схемы грантов на фундаментальные исследования [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 6-гидроксидофамин (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Миссури, США | 162957 | |
| Аскорбиновая кислота | Thermo Fisher Scientific, Калифорния, США | FKC#A/8882/53 | |
| Одноразовая пастеровская пипетка, 3 мл | Thermo Fisher Scientific, Калифорния, США FB55348 | ||
| Микроцентрифужная пробирка, 0,2 мл | Eppendorf, Гамбург, Германия | 30124332 | |
| Nice коническая колба, 100 мл | Evergreen Engineering & Ресурсы, Семеньих, Малайзия | SumYau0200 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Sigma-Aldrich, Миссури, США | P4417 | |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich, Миссури, США | S5761 | |
| Хлорид натрия | Merck, Дармштадт, Германия | 106404 | |
| Стереомикроскоп | Nikon, Токио, Япония | SMZ745 | |
| Трикаин метансульфонат (MS-222) | Sigma-Aldrich, Миссури, США | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze программное обеспечение | Stoelting Co., Иллинойс, | США-версия | 7.0; программное обеспечение для отслеживания видео |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Gö Тинген, Германия | SE 2 | |
| FemtoJet IV микроинъектор | Eppendorf, Гамбург, Германия | 5192000035 | |
| Femtotip II, стерильный инъекционный капилляр | Eppendorf, Гамбург, Германия | 5242957000 | |
| микроманипулятор InjectMan 4 | Eppendorf, Гамбург, Германия | 5192000027 | |
| светодиодная портативная лампа | MR. DIY, Селангор, Малайзия | 9023251 | 20 мАч |
| PELCO Pro Superalloy, офсет, тонкие наконечники | Ted Pella, Калифорния, США | 5367-12NM | |
| Shanda Аквариум | Yek Fong, Селангор, Малайзия | SDH-228 | |
| Термометр | Sera Precision, Хайнсберг, Германия | 52525 | |
| Видеокамера | Nikon, Токио, Япония | D3100 |
Ссылки
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
