Cet article explique comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement cryo-EM, à savoir cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3, pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données monoparticulaires pour la détermination de la structure à haute résolution.
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Article de méthode
Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les progrès récents dans les logiciels d’instrumentation et de traitement d’images ont fait de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) la méthode préférée des biologistes structuraux pour déterminer les structures à haute résolution d’une grande variété de macromolécules. Plusieurs suites logicielles sont disponibles pour les utilisateurs nouveaux et experts pour le traitement d’image et le calcul de structure, qui rationalisent le même flux de travail de base: les films acquis par les détecteurs de microscope subissent une correction pour l’estimation de la fonction de transfert de mouvement et de contraste induit par faisceau (CTF). Ensuite, les images de particules sont sélectionnées et extraites des images de film moyennées pour une classification itérative 2D et 3D, suivie d’une reconstruction, d’un raffinement et d’une validation 3D. Parce que divers progiciels utilisent des algorithmes différents et nécessitent différents niveaux d’expertise pour fonctionner, les cartes 3D qu’ils génèrent diffèrent souvent en qualité et en résolution. Ainsi, les utilisateurs transfèrent régulièrement des données entre une variété de programmes pour des résultats optimaux. Cet article fournit un guide permettant aux utilisateurs de naviguer dans un flux de travail à travers les progiciels populaires : cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 afin d’obtenir une structure de résolution quasi atomique du virus adéno-associé (AAV). Nous détaillons d’abord un pipeline de traitement d’image avec cryoSPARC v3, car ses algorithmes efficaces et son interface graphique facile à utiliser permettent aux utilisateurs d’arriver rapidement à une carte 3D. Dans l’étape suivante, nous utilisons PyEM et des scripts internes pour convertir et transférer les coordonnées des particules de la meilleure reconstruction 3D obtenue dans cryoSPARC v3 vers RELION-3 et Scipion 3 et recalculer les cartes 3D. Enfin, nous décrivons les étapes à suivre pour affiner et valider davantage les structures résultantes en intégrant les algorithmes de RELION-3 et Scipion 3. Dans cet article, nous décrivons comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données pour la détermination de la structure haute résolution.
Introduction
La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et l’analyse monoparticulaire (SPA) permettent de déterminer la structure d’une grande variété d’assemblages biomoléculaires à l’état hydraté, contribuant ainsi à éclairer les rôles de ces macromolécules dans les détails atomiques. Les améliorations apportées à l’optique du microscope, au matériel informatique et aux logiciels de traitement d’images ont permis de déterminer les structures des biomolécules à une résolution supérieure à 2 Å1,2,3. Plus de 2 300 structures cryo-EM ont été déposées dans la banque de données sur les protéi....
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Protocole
1. Création d’un nouveau projet cryoSPARC v3 et importation de données
REMARQUE: Les données ont été acquises à l’Oregon Health and Science University (OHSU) à Portland à l’aide d’un microscope électronique Titan Krios de 300 kV équipé d’un détecteur d’électrons directs Falcon 3. Les images ont été collectées en mode comptage avec une dose totale de 28,38 e−/Å2 fractionnée sur 129 images, et une plage de mise au point de -0,5 μm à -2,5 μm, à une taille de pixel de 1,045 Å en utilisant l’EPU. L’échantillon d’AAV-DJ a été fourni par le personnel de l’OHSU.
- Ouvrez cryoSPARC v3 dans un navigateur....
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Résultats
Nous avons présenté un pipeline SPA complet pour obtenir une structure haute résolution en utilisant trois plates-formes de traitement différentes : cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3. Les figures 1 et 4 résument le flux de travail de traitement général et le tableau 1 détaille les protocoles d’affinement. Ces protocoles ont été utilisés lors des raffinements d’une structure de 2,3 Å de l’AAV, atteignant une résolution proche de Nyquist.
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Discussion
Dans cet article, nous présentons un flux de travail SPA robuste pour le traitement des données cryo-EM sur diverses plates-formes logicielles afin de réaliser des reconstructions 3D haute résolution (Figure 1). Ce flux de travail est applicable à une grande variété de macromolécules biologiques. Les étapes suivantes du protocole sont décrites à la figure 4, y compris le prétraitement du film, la sélection et la classification des particules, ainsi que plusieurs.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Carlos Oscar Sorzano pour son aide à l’installation de Scipion3 et Kilian Schnelle et Arne Moeller pour son aide au transfert de données entre différentes plates-formes de traitement. Une partie de cette recherche a été soutenue par la subvention U24GM129547 des NIH et réalisée au PNCC de l’OHSU et accessible via EMSL (grid.436923.9), une installation d’utilisateurs du DOE Office of Science parrainée par l’Office of Biological and Environmental Research. Cette étude a été soutenue par une subvention de démarrage de l’Université Rutgers à Arek Kulczyk.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Université de Californie, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratoire de biologie structurale | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Centre de traitement d’images (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Ressource pour la bioinformatique, Visualisation et | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
Références
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M.,
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Réimpressions et autorisations
