본 프로토콜은 캔틸레버 굽힘 설정에서 뮤린 대퇴목에 대한 재현 가능한 테스트 플랫폼의 개발을 설명합니다. 사용자 지정 3D 인쇄 가이드는 최적의 정렬로 대퇴골을 일관되고 엄격하게 고정하는 데 사용되었습니다.
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본 프로토콜은 캔틸레버 굽힘 설정에서 뮤린 대퇴목에 대한 재현 가능한 테스트 플랫폼의 개발을 설명합니다. 사용자 지정 3D 인쇄 가이드는 최적의 정렬로 대퇴골을 일관되고 엄격하게 고정하는 데 사용되었습니다.
대퇴목의 골절은 골다공증을 가진 개별에서 일반적입니다. 많은 마우스 모형은 1 차적인 결과 측정으로 생체 기계시험을 가진 질병 상태 및 치료를 평가하기 위하여 개발되었습니다. 그러나 전통적인 생체 기계 테스트는 긴 뼈의 중간 축에 적용되는 비틀림 또는 굽힘 테스트에 중점을 둡니다. 이것은 일반적으로 골다공증 개별에 있는 고위험 골절의 사이트 아닙니다. 따라서, 골다공증 환자가 경험하는 골절의 유형을 더 잘 복제하기 위해 캔틸레버 굽힘 로딩에서 뮤린 대퇴골의 대퇴골목을 테스트하는 생체 기계적 테스트 프로토콜이 개발되었다. 생체 역학적 결과는 대퇴목에 비해 굴곡 적재 방향에 크게 의존하기 때문에, 3D 프린팅 가이드는 적재 방향에 비해 20° 각도로 대퇴 샤프트를 유지하기 위해 만들어졌습니다. 새로운 프로토콜은 정렬의 가변성을 감소시킴으로써 테스트를 간소화 (21.6 ° ± 1.5 °, COV = 7.1%, n = 20) 측정 된 생체 역학 결과 (평균 COV = 26.7 %). 신뢰할 수 있는 시편 정렬을 위한 3D 프린팅 가이드를 사용하는 새로운 접근 방식은 골다공증의 마우스 연구에서 샘플 크기를 최소화해야 하는 시편 정렬 불량으로 인한 측정 오류를 줄임으로써 엄격성과 재현성을 향상시킵니다.
골절 위험은 골다공증과 관련된 심각한 의학적 관심사입니다. 150만 개 이상의 취약성 골절은 미국에서만 매년 보고되며, 엉덩이, 특히 대퇴목에서 주요 골절 유형1이 발생하는 골절이 발생합니다. 여성의 18%와 남성의 6%가 일생동안 대퇴목 골절을 경험할 것으로 추정되며, 골절 후 1년차 사망률은 20%1보다 큽습니다. 따라서 대퇴목의 생체 역학 적 테스트를 허용하는 마우스 모델은 취약성 골절을 연구하는 데 적합 할 수 있습니다. 마우스 모델은 또한 잠재적으로 골다공증에 관련된 번역 가능한 세포 및 분자 사건을 해명하기 위하여 강력한 공구를 제공합니다. 이것은 유전 기자의 가용성, 기능 모델의 이득 및 손실, 분자 기술 및 시약의 광대 한 라이브러리 때문입니다. 마우스 뼈의 기계적 테스트는 질병의 병인학을 설명할 수 있는 뼈 건강, 지장및 현상 변이를 결정하는 데 필요한 결과 측정을 제공하고, 뼈의 질과 골절의 위험의 결과 측정에 근거하여 치료를 평가할 수 있습니다3.
대퇴목의 해부학은 일반적으로 굴곡 (굽힘) 골절로 이어지는 독특한 기계적 적재 시나리오를 만듭니다. 대퇴골 머리는 대퇴골의 근간 끝에 있는 아세타큘러 소켓에 적재됩니다. 이것은 대퇴목의 캔틸레버 굽힘 시나리오를 생성하며, 이는 대퇴샤프트에 엄격하게 부착됩니다4. 이것은 대퇴골 중간 diaphysis에 전통적인 3- 또는 4 점 굽힘 시험과 다릅니다. 이러한 테스트는 도움이 되지만 일반적으로 골절 위치 또는 로딩 시나리오 측면에서 골다공증 및 골다공증 개인의 취약성 골절로 이어지는 로딩을 복제하지는 않습니다.
쥐의 취약성 골절 위험을 더 잘 평가하기 위해, 그것은 뮤린 대퇴목의 캔틸레버 굽힘 테스트의 재현성을 개선하기 위해 노력했다. 이론적으로 예측된 바와 같이, 대퇴샤프트에 비해 대퇴골 헤드의 적재각도가 결과측정값에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이로 인해 보고된 결과의 신뢰성과 재현성에 대한 도전이 생기다. 시료 준비 중 대퇴골의 적절하고 일관된 정렬을 보장하기 위해 C57BL/6 마우스 대퇴골의 μCT 스캔에 따라 3D 인쇄된 가이드를 설계했습니다. 가이드는 대퇴 샤프트가 수직 적재 방향에서 ~20° 유지되도록 일관되게 샘플을 포팅하는 데 도움을 주도록 설계되었습니다. 이 각도는 대퇴목 골절의 가능성을 높이고 보다 일관되고 재현 가능한 테스트5로 이어지는 대퇴골 샤프트를 따라 최대 굽힘 순간을 최소화하면서 강성을 극대화하기 때문에 선택되었습니다. 가이드는 샘플 간의 해부학적 차이를 수용하기 위해 다양한 크기로 3D 인쇄되었으며 아크릴 뼈 시멘트에서 포팅하는 동안 샘플을 안정적인 위치에 보관하는 데 사용되었습니다. 강성, 최대 힘, 수율 력 및 최대 에너지는 힘 변위 그래프에서 계산되었습니다. 이 테스트 방법은 전술한 생체 역학적 결과에 대한 일관된 결과를 보여주었다. 3D 프린팅 가이드의 연습과 도움으로 정렬 불량으로 인한 측정 오류를 최소화하여 신뢰할 수 있는 결과 측정을 할 수 있습니다.
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동물 연구는 로체스터 동물 자원의 대학 위원회에 의해 승인되었다. 이 연구에서 사용된 마우스는 나이의 24-29 주에서 구역 수색하는 C57BL/6 남성과 여성이었습니다. 마우스는 음식과 물 광고 리비툼과 표준 조건에 보관되었다. 이산화탄소 흡입을 통한 안락사 시 자궁 경부 탈구가 이어졌고, 20개의 오른쪽 대퇴골(10명의 남성과 10마리 암컷)을 시험할 때까지 -20°C에서 수확및 냉동하였다.
1. 사용자 정의 3D 인쇄 장착 가이드의 생성
참고: 다른 균주와 유전 표현형이 다른 해부학 적 기하학을 가질 수 있기 때문에이 단계가 필요할 수 있습니다.

도 1: μCT 분석. C57Bl/6 마우스의 대퇴골의 μCT 이미지는 중간축의 중심을 통해 더 큰 트로챈터의 상부에서 측정된 평균 샤프트 각도를 계산하는 데 사용되며, ~7mm 는 distally된다. 중간축 직경도 이 위치에서 측정되었다. 근위 대퇴골의 3D 렌더링은 전방 뷰에서 세 번째 트로챈터의 프로파일을 표시하기 위해 지향되었습니다. 평균 샤프트 각도는 93.13°(SD = 1.19°)였으며 평균 중간 축 직경은 1.53mm(SD = 0.14mm) (n = 20)였다. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 가이드 설계. (A) 3D 스케치 및 (B) 3D 프린팅 전에 미드샤프트 앵글링 설비의 시각화. 이전 문헌에 기초하여, 20° 사이의 중간 축 각도는 강성을 극대화합니다. 대퇴샤프트의 최대 굽힘 순간을 최소화하여 목에서 골절이 발생하고 기계적 결과의 가변성을 보장합니다5. 중간축 평균 각도에서 수직에서 3.13° 편차를 보정하기 위해 고정 각도를 73.13°로 설정하여 20°의 각도를 생성했습니다. 정렬 설비는 다양한 미드샤프트 직경에 적합한 지름1.9-2.2mm로 인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 샘플 준비

그림 3: 사용자 지정 지그와 앵글링 비품을 사용하여 샘플 준비. (A) 적절한 정렬을 가진 알루미늄 냄비의 샘플은 뼈 시멘트가 건조되는 동안 3D 인쇄 가이드를 사용하여 유지됩니다. (B) 테스트 전에 엑스레이는 대퇴골의 말단을 둘러싼 앵글링 비품의 그림자와 뼈 시멘트의 완전한 커버리지를 보여줍니다. 알루미늄 냄비 의 바닥에 포화 흰색 영역은 퍼티, 경화 할 때 냄비에 뼈 시멘트를 유지하는 데 사용됩니다. 스케일 표시줄(패널 B) = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 하드웨어 설정

그림 4: 하드웨어 설정. (A) 적절한 시료 포지셔닝을 보장하기 위해 1kN 로드 셀(해상도 < 1 N) 및 검은색 양축 스테이지를 갖춘 기계 테스트 시스템에 대한 테스트 설정. (B) M10 스레드 로드와 알루미늄 냄비를 제자리에 고정하는 데 사용되는 두 개의 M4 볼트로 로드 셀에 부착된 3D 인쇄 장착 설비를 닫습니다. (C) 테이퍼 로딩 기구가 있는 스테레오 현미경을 통해 시료를 볼 수 있습니다. 스케일 표시줄(패널 C) = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 소프트웨어 설정
5. 테스트 설정

그림 5. 샘플 정렬 평가. (A) 수직에서 샤프트 각도는 평면 디지털 엑스레이에서 측정됩니다. (B) 대표적인 화분 샤프트 각도는 18.11°에서 23.99°까지 다양하며, 7.1%(n=20)의 변동 계수(COV)가 있었다. 해부학적 변화로 인한 성차이는 한 꼬리를 결합하지 않은 t-test(p < 0.05)를 사용하여 결정된 바와 같이 통계적으로 유의하지 않았다. 스케일 표시줄(패널 A) = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 테스트 후 샘플의 X선 이미지입니다. 대퇴목과 대퇴목 샤프트 부착(주황색 원강조)을 따라 양분된 선으로 골절된 모든 샘플. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 데이터 분석
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가이드의 도움으로 화분에 넣으면 대퇴 샤프트가 21.6 ° ± 1.5 °로 정렬되었습니다. 이는 20°의 의도된 각도에서 <10% 편차를 나타내지만, 테스트된 모든 샘플에 걸쳐 포팅 각도의 변이(COV)의 계수는 시험 전 평면 엑스레이(그림 5)에 의해 확인된 바와 같이 각각 남성과 여성 마우스의 경우 7.6%와 6.5%였다. 또한 테스트 후 X선을 사용하여 샘플이 실패한 모드를 평가해야 합니다. 고장은 대퇴목에서 일관되게 관찰되었으며, 의도한 대로, 대퇴골 샤프트와 평행한 하나의 골절 라인과 대퇴목에 수직인 다른 선(도 6)을 병행시켰다. 시료 간의 파손 패턴에서 상당한 변화가 발생하는 경우, 체적 뼈 미네랄 밀도, 반구 및 피질 두께, 간격 및 광물화와 같은 결과를 측정하여 샘플의 뼈 품질을 μCT를 통해 더 평가될 수 있습니다. 대퇴목에서 일관되게 실패가 유도되지 않으면 3D 프린팅 가이드가 조정...
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이 프로토콜은 뮤린 대퇴목에 대한 신뢰할 수있는 캔틸레버 굽힘 테스트를 간략하게 설명합니다. 대퇴목에서 발생하는 천연 캔틸레버 플렉스 시나리오는 일반적으로 표준 3점 및 4점 굽힘 테스트5에서 표현되지 않습니다. 이 시험 방법은 뼈 취약성 환자에 의해 경험된 대퇴목 골절의 모형을 더 좋고 더 안정적으로 복제합니다. 이 프로토콜을 수행할 때 주요 초점은 대퇴샤프트의 일관성 없는 포팅으로 인한 가변성을 제거하는 것입니다. 비판적으로, 프로토콜의 첫 번째 및 네 번째 섹션에 설명된 단계를 면밀히 살펴보면 가이드와 로딩 프로토콜이 이 출판물에 보고된 내용을 복제할 수 있습니다. 이론적으로 예측 및 실험적으로 보여 질 수 있듯이, 로딩 축에 상대하는 중간 축 각도는 대퇴목과 대퇴목에서 골절이 발생할 확률에 의해 경험되는 응력에 영향을 미칠 수 있다. 이전 그룹은 중간 축 각도가 대퇴골 머리를 통해로드 할 때 대퇴골의 압축 강성과 강도에 크게 영향을 미친다는 것을 입증했다. 중간샤프트 경사 각도의...
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저자는 공개 할 것이 없습니다.
이 연구는 NIH P30AR069655 및 R01AR070613(H. A.A.)에 의해 지원되었습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ¼ ” x ¼ ” 사각 알루미늄 튜빙 | Grainger | 48KU67 | 1/2"에서 1" 길이로 절단 |
| 1kN 로드셀 | Instron | 2527-130 | 1N 미만의 해상도를 가진 모든 로드셀을 사용할 수 있습니다. |
| 3.5x-45x 줌 스테레오 붐 현미경 | Omano | OM2300S-GX4 | 현미경은 로딩 플래튼으로 샘플을 정확하게 정렬하는 데 사용됩니다. |
| 3D 프린팅 가이드 | 73.13°C의 맞춤형 앵글 슬롯, 직경 1.9mm에서 2.2mm 사이 | ||
| 아크릴베이스 플레이트 재료 키트 | Keystone Industries | 921392 | 3.5g의 분말과 2mL의 액체를 혼합합니다. 이것은 약 8 샘플에 충분하며 빠르게 경화되기 시작합니다. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | 컴파일 &마이크로에 사용됨; CT 스캔 | |
| 이축 단계 | 맞춤 제작 | 로딩 플래튼 아래 샘플의 대퇴골두를 중앙에 배치하는 데 사용됩니다. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | formlabs의 모든 수지를 이 프로젝트에 사용할 수 있습니다. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | 소프트웨어는 하중 프로토콜을 설정하고 하중, 변위 및 시간 데이터를 수집하는 데 사용됩니다. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | 기계적 테스트 시스템 |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | 마운트 및 가이드 인쇄에 사용 |
| 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank는 BioMed Resin ImageJ National과 호환되도록 사용되었습니다. |
| Institutes of Health | ImageJ | µ를 평가하는 데 사용됩니다. CT 및 X-ray 이미지 | |
| Laxco iLED 시리즈 LED 광원 | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | 현미경과 결합하는 데 사용되는 광원. |
| 로딩 플래튼 | 맞춤 제작 | 이것은 약 2.5mm의 직경으로 가늘어지는 모든 금속 막대가 될 수 있습니다. 우리는 선반에서 가늘어지는 M6 나사를 사용했습니다. | |
| 마운트 부착물 | 맞춤 제작 | 3D 프린팅 마운트를 로드 셀에 고정합니다. 우리는 M10/M6 나사산 막대 | |
| 인산염 완충액 식염수(PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 사용하여 아크릴 베이스 플레이트 재료가 굳으면 샘플을 재수화했습니다. |
| 배관공의 퍼티 | Oatey | 31174 | 아크릴베이스 플레이트 재료를 부을 때 알루미늄 튜브의 끝을 밀봉하는 데 사용됩니다. 모든 점토 또는 퍼티를 사용할 수 있습니다. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs 소프트웨어 |
| 조직 배양 접시 | Corning | 353003 | 샘플은 배양 접시에 평평하게 놓고 PBS로 덮어 수분을 보충할 수 있습니다. |
| vivaCT 40 | Scanco | µ CT 40 | 대표 세트 또는 실제 샘플은 대퇴골 각도와 직경을 계산하기 위해 가이드를 인쇄하기 전에 스캔할 수 있습니다. |
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