곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

요약

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

초록

토양은 엄청난 양의 미생물 생명체의 숙주이며, 각 그램에는 수십억 개의 박테리아, 고고 및 곰팡이 세포가 포함되어 있습니다. 효모로 광범위하게 정의 된 곰팡이 및 단세포 균류와 같은 다세포 균류는 유기 물질의 분해제 및 다른 토양 거주자를위한 식량원으로서 토양 생태계에서 필수적인 역할을 수행합니다. 토양의 곰팡이 종의 다양성은 강우량 및 온도와 같은 다양한 기후 요인뿐만 아니라 유기물, pH 및 수분을 포함한 토양 특성에 달려 있습니다. 특히 아시아, 아프리카, 남미 및 중앙 아메리카 지역에서 적절한 환경 샘플링이 부족하면 토양 곰팡이 공동체의 특성화와 새로운 종의 발견을 방해합니다.

우리는 ~ 4,000 토양 샘플과 효모와 곰팡이의 분리를 위해 실험실에서 개발 된 프로토콜을 사용하여 여섯 대륙의 아홉 개국의 토양 곰팡이 공동체를 특성화했습니다. 이 프로토콜은 박테리아 성장을 억제하면서 액체 배지에서 효모와 의학적으로 관련된 곰팡이 Aspergillus fumigatus에 대한 별도의 선택적 농축으로 시작됩니다. 생성 된 콜로니는 고체 배지로 옮겨지고 순수한 배양물을 얻기 위해 추가로 처리되고 하류 유전 적 특성화가 뒤 따른다. 효모 종 동일성은 핵 리보솜 RNA 유전자 클러스터의 내부 전사 스페이서 (ITS) 영역의 시퀀싱을 통해 확립되며, A. fumigatus의 글로벌 인구 구조는 마이크로 위성 마커 분석을 통해 탐구됩니다.

이 프로토콜은 카메룬, 캐나다, 중국, 코스타리카, 아이슬란드, 페루, 뉴질랜드 및 사우디 아라비아의 토양 효모 및 A. fumigatus 개체군을 분리하고 특성화하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 발견은 토양 효모 다양성의 글로벌 패턴뿐만 아니라 A. fumigatus의 글로벌 인구 구조 및 항진균 저항 프로파일에 대한 많은 필요한 통찰력을 보여주었습니다. 이 논문은 국제 토양 샘플에서 효모와 A. fumigatus를 분리하는 방법을 제시합니다.

서론

토양 생태계의 곰팡이는 유기물 분해, 영양 순환 및 토양 시비에 필수적인 역할을합니다¹. 배양-독립적(즉, 고처리량 시퀀싱) 및 배양-의존적 접근법 둘 모두는 토양 진균 ^2,3의 연구에 널리 사용된다. 고처리량 메타바코드 시퀀싱에 의해 생성된 다량의 데이터는 공동체 구조와 다양성의 광범위한 패턴을 밝히는 데 유용하지만, 문화 의존적 접근 방식은 순수한 곰팡이 배양의 가용성으로 인해 다운스트림 다양성 및 기능 분석을 통해 개별 유기체의 분류 및 기능 구조에 대한 매우 보완적인 정보뿐만 아니라 개별 유기체의 보다 구체적인 프로파일을 제공할 수 있습니다.

토양 그램 당 수천 개의 세포를 거의 초과하지 않음에도 불구하고, 단세포 균류로 광범위하게 정의 된 효모는 다른 토양 거주자 ^4,5에게 필수적인 분해제 및 식품 공급원입니다. 사실, 효모는 남극 대륙 ^6,7과 같은 차가운 생물권에서 우세한 토양....

프로토콜

참고 : 국제 토양 샘플 및 / 또는 A. fumigatus 포자 및 균사체를 활용하는 모든 단계는 레벨 2 유기체 (BSCII)의 생물 안전 캐비닛 내에서 작업해야합니다.

1. 토양에서 효모의 분리

1. 항균 및 항진균 용액의 제조
   1. 클로람페니콜 분말을 70% 에탄올에 현탁하여 50g/L 원액을 제조하였다. 주사기 여과에 의해 멸균하고 4°C에서 보관한다.
      참고 :이 항생제는 토양 효모 격리 중에 대부분의 박테리아의 성장을 방지합니다. 클로람페니콜 내성 박테리아가 여전히 성장할 수 있기 때문에, 효모와 박테리아를 구별할 때 콜로니 형태학을 신중하게 고려해야 합니다. 항생제 내성 박테리아 균주를 함유하는 것으로 의심되는 토양으로 작업할 때 추가적인 항생제가 배지에 첨가될 수 있다. 클로람페니콜이 보충된 배지의 세균 오염은 효모를 환경 토양에서 분리할 때 발생하는 문제가 되지 않았습니다.
   2. 베노밀 분말을 DMSO에 현탁하여 5 g/L 원액을 제조하였다. 주사기 여과에 의해 멸균하고 4°C에서 보관한다.
      참고 :이 선택적 항진균제는 토양 효모 분리^26,27

결과

토양으로부터의 효모 분리
상기 효모 분리 프로토콜은 ^{9,12개국 9,12}개국의 53개 지역에서 유래한 토양 샘플로부터 효모를 배양하기 위해 구현되었다. 전체적으로, 1,473개의 효모 균주가 3,826개의 토양 샘플로부터 분리되었다. 아홉 개의 원산지 국가의 상이한 기후 조건을 고려할 때, 각 국가의 최상의 배양 온도는 그것의 평균 연간 온도에 기초하여 결정되었다 (표 1). 14°C에서 더 느린 효모 성장을 감안할 때, 아이슬란드로부터의 토양 샘플을 롤러 드럼 상에서 추가로 48 h (총 96-120 h) 동안 인큐베이션하였다. 고체 배지 상에서 2-3일간 배양한 후, 미생물 성장은 모든 샘플에 대한 플레이트 상에서 가시화되었다(도 1A). 플레이트 상에 존재하는 각각의 효모 형태학에 대해 무작위로 선택된.......

토론

토양에서 효모와 A. fumigatus 를 분리하기 위해 개발 된 프로토콜은 높은 처리량의 토양 처리 및 곰팡이 격리를위한 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜은 샘플 당 소량의 토양 (0.1-0.2g) 만 필요하므로 비슷한 노력으로 더 많은 사이트를 샘플링 할 수 있습니다. 빠른 처리 시간을 통해 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있으며 필요한 경우 문제 해결 및 반복 실험을 위한 시간을 허용합니다. 이 프로토콜은 표준 미생물학 및 세포 배양 장비를 사용하여 많은 실험실 환경에서 쉽게 복제 할 수 있습니다. 그러나 효모 나 곰팡이를 국제 토양에서 분리 할 때 추가 예방 조치가 필요합니다. 플라스틱 트레이 및 셀 스프레더와 같은 모든 비 일회용 플라스틱 장비는 10 % 표백제에 침수시킨 다음 오토 클레이빙하여 멸균해야합니다. 사용 된 벤치 코트는 비닐 봉지에 밀봉하고 폐기하기 전에 오토클레이브에서 멸균해야합니다.

참고로, 상기 프로토콜을 사용하여 단리된 효모의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Sarstedt Inc	72.690.001
베노밀 분말	토론토 연구 화학 물질	B161380
클로람페니콜 분말	Sigma-Aldrich	SKU: C0378-5G
덱스트로스	Sigma-Aldrich	SKU: D9434-500G
단편 분석 소프트웨어	NCBI의 Osiris		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS 염기서열 데이터베이스	NCBI GenBank		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS 시퀀스 데이터베이스	UNITE		https://unite.ut.ee/
Peptone	Sigma-Aldrich	SKU: P5905-500G
재사용 가능한 세포 스프레더	Fisher Scientific	08-100-12
멸균 10cm 지름의 페트리 접시	Sarstedt Inc	83.3902
멸균 13 mL 배양 튜브	Sarstedt Inc	62.515.006
나무 평면 팁 애플리케이터 스틱	Fisher Scientific	23-400-112
효모 추출물	Sigma-Aldrich	SKU: Y1625-250G