Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדגימה גנטית לא פולשנית של אוכלוסיות פרפרים בהתבסס על איסוף שדה של שאריות פסולת ביצים. ניתן להשתמש בו כדי לאשר את זהות המין ולכמת שונות גנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לקבוצות רחבות יותר למעורבות מדעית קהילתית.
Abstract
הירידה העולמית במספר החרקים ממשיכה להאיץ. דגימה גנטית יעילה נחוצה באופן קריטי כדי לקדם את ההבנה של טקסונים רבים ולטפל בפערי ידע קיימים. פרוטוקול זה מייצג שיטה מוכחת לדגימה ללא הפרעה של פרפרים נדירים עבור מבנה גנטי של אוכלוסייה או ניתוחי ברקוד DNA. הוא משתמש בכוריון של ביצות פרפר שבקעו כדי להניב דנ"א בכמות ובאיכות גבוהות מספיק לריצוף גנים מוצלח כדי לאשר את זהות המינים ולכמת את השונות הגנטית. זה עשוי להיות שימושי במיוחד כאשר טכניקות אחרות לדגימת רקמות אינן מעשיות או אינן זמינות. למרות שפותח עבור לפידופטרן, הוא בכל זאת יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם מיני חרקים אחרים. הוא תוכנן במיוחד עם קלות שימוש במטרה לסייע למקסם את היישום הרחב על ידי אנשים בעלי ניסיון ורמות מיומנות שונות, כגון מדעני קהילה, אנשי שימור וסטודנטים, ולשימוש על פני אזורים גיאוגרפיים גדולים כדי להקל על דגימת אוכלוסייה רחבה. הנתונים המופקים יכולים לסייע בקבלת החלטות טקסונומיות ורישום, פעולות שימור וניהול, ולשפר את המחקר האקולוגי הבסיסי.
Introduction
דגימה גנטית יעילה של אוכלוסיות של חרקים נדירים, יורדים ו/או רשומים היא לעתים קרובות קריטית כדי לסייע בפעולות שימור וניהול מושכלות. שיטות דגימת רקמות קטלניות או מזיקות משמשות באופן שגרתי לניתוחים גנטיים רבים. עם זאת, שיטות אלה אינן רצויות או אינן מותרות משום שהן עלולות לגרום נזק לאוכלוסיות פגיעות או להשפיע לרעה על ההתנהגות והכושר. טכניקות דגימה לא קטלניות או לא פולשניות שונות המערבות רקמות כגון רגליים שלמות, גזירי אנטנות או כנפיים, אקסוביית זחלים או המולימפה מהפרשות הגנתיות ומוצרים אחרים, כגון פרס, התאימו למחקר גנטי של חרקים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . ההיתכנות והישימות הכוללת של טכניקות דגימת רקמות שונות אלה משתנות באופן משמעותי בהתבסס על הביולוגיה, האקולוגיה, ההתנהגות, הגודל והנדירות של האורגניזם המוקדי, המצב והאנשים שאוספים את החומר. לדוגמה, רגליים שלמות או גזירי נספחים דורשים לכידה זמנית וטיפול זהיר של מספר אנשים בשלב חיים מתאים, בדרך כלל על ידי אנשי צוות מנוסים. באופן דומה, מקורות רקמות, כגון exuviae זחל או frass, עשויים להיות מעשיים רק אם האורגניזמים נמצאים בשבי או מוחזקים באופן זמני לתקופה מספקת.
עבור שאלות מחקר הנשאלות ברמת האוכלוסייה, כגון אלה הנוגעות להבחנה טקסונומית פוטנציאלית או למבנה גנטי, לעתים קרובות נדרשת דגימה בקנה מידה זמני או גיאוגרפי רחב יותר (כלומר, אזורי או יבשתי). כתוצאה מכך, מקורות רקמה לא פולשניים מסוימים עשויים להיות בלתי מעשיים לחלוטין או לכל הפחות לא יעילים לאיסוף בכמות. איסוף דגימות בקני מידה כאלה עשוי להיות גם לא מעשי מבחינה לוגיסטית או כלכלית או לאסור על חוקרים בודדים או אפילו צוותי שטח קטנים יותר לבצע. בעוד שהמעורבות הישירה של מדעני הקהילה אומצה יותר ויותר על ידי קהילת המחקר כדי לעזור להתמודד עם רבים מהאתגרים הללו ולהאיץ איסוף מבוסס ביג דאטה, האימוץ הוגבל עבור מחקרים הכוללים דגימת דנ"א לא פולשני, לא פולשנית או דנ"א סביבתי 10,11,12.
כדי לעזור להתגבר על כמה מהמגבלות הפוטנציאליות האלה, הראינו שכוריון מביצות הפרפר שבקעו יכול להניב כמות ואיכות דנ"א גבוהות מספיק לריצוף גנים מוצלח כדי לאשר את זהות המינים ולכמת את השונות הגנטית. לאחר מכן בדקנו פרוטוקולי איסוף שונים בטכניקה זו13. עבודת פיילוט זו שימשה בסיס לעידון מתודולוגי נוסף. מאמר זה מתאר בפירוט את פרוטוקול איסוף השטח המתוקן הפשוט אך המקיף שנוצר עבור מדעני הקהילה ואנשי צוות אחרים שאינם מומחים. פרוטוקול זה הוא חלק מניתוח מבנה אוכלוסייה רחב טווח של פרפר האלפין הקפוא (Callophrys irus) כדי לסייע בפעולות שימור עתידיות ובקביעה פדרלית של רישום אפשרי תחת חוק המינים בסכנת הכחדה בארה"ב. אף על פי שהוא עשוי להיות עתיר עבודה יותר מכמה שיטות לא פולשניות, היעדר מגע הכרחי עם אורגניזמים וקלות השימוש הופכים אותו למודל בר-קיימא שניתן ליישם בתוכניות מחקר גנטיות אחרות של אוכלוסיות המכוונות למבחר של חרקים נפוצים ושל בעלי דאגה לשימור, המותירים אחריהם שאריות של פסולת ביצים מנימפות או זחלים שבקעו לאחרונה. שפת הפרוטוקול המוצגת כאן פותחה במיוחד עבור פרפרים במשפחה Lycaenidae ולשימוש על ידי לא-מומחים המוגדרים כאן כמדעני קהילה או אנשים אחרים (למשל, ביולוגים של סוכנויות, מתמחים) עם ניסיון אנטומולוגי מוגבל.
Protocol
1. הפצת אספקה למדעני הקהילה
- סקור בקפידה ואסוף את הרשימה המלאה של אספקה הקשורה לאיסוף הדרושה על ידי התייעצות עם טבלת החומרים המלאה.
- אם איסוף הדגימות יתבצע במספר מיקומים ו/או על ידי מספר אנשים/צוותים, אסוף וארגן את כל האספקה הדרושה ליחידות נפרדות הניתנות לפריסה (איור 1 ואיור 2).
- הובלת אספקה (יחידות הניתנות לפריסה) למדעני הקהילה או לאנשי צוות אחרים האחראים על איסוף בשטח.
- אם כוח האדם אינו מקומי, ארוז בזהירות אספקה (כל יחידה הניתנת לפריסה) לתוך קופסת משלוח נפרדת מקרטון עם תווית משלוח מלאה ומשלוח.
הערה: משלוח מזורז אינו נדרש בשלב זה.
2. הכנת אוסף מדעני הקהילה
- עם קבלת חומרי האיסוף, כולל תיבת האיסוף, יש לעיין בקפידה ברשימת האספקה הלמינציה ולערוך מלאי מלא. הודע למנהל הפרוייקט אם חסרה אספקה כלשהי.
- מלאו מראש צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל במאגר תזה של 180 מיקרו-ליטר, החילו תוויות עם תווית מזהה ייחודית מודפסת מראש על כל צינור מיקרוצנטריפוגה, והניחו את כל הצינורות בתיבת האחסון של צינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 64 בארות. הדקו היטב את המכסה לאחר הטעינה.
הערה: אם מדפסות מדבקות אינן זמינות, החל מספרי זיהוי ייחודיים על הצד והמכסה של כל בקבוקון באמצעות סמן חסין אתנול. - ודא שכל הציוד הדיגיטלי (למשל, טלפון חכם או מצלמה) טעון במלואו, וכל הסוללות הרזרביות ארוזות היטב.
- מלאו חלקית צידנית קטנה בקרח לאחסון שדה ולהובלה מקומית של הדגימות שנאספו.
- ארוז את כל חומרי האיסוף לתוך תיבת האיסוף או מיכל חזק ועמיד בפני מזג אוויר דומה להובלה בטוחה ואחסון מאוחד.
- סקור בפירוט את פרוטוקול איסוף הדגימות הגנטיות הלא פולשניות לפני היציאה לשטח.
הערה: השתמש בפרוטוקול למינציה ומעובה ומאויר לקבלת הנחיות נוספות בשטח (איור משלים S1 ואיור משלים S2).
3. איסוף דגימות בשטח
- עם ההגעה לאתר השדה, השתמש בעיפרון או בעט לכל מזג אוויר כדי לרשום במחברת השדה העמיד בפני מזג האוויר את השעה ביום, תאריך, שם הנכס הכולל (לדוגמה, היער הלאומי אפלצ'יקולה), שם או תיאור ספציפי של אתר השדה, וקריאת GPS אם זמין, ואת השם המלא והתפקידים של כל הנוכחים.
- אתר בית גידול מתאים עם נוכחות של מיני צמחים מארחים זחליים ספציפיים לפרפר המטרה.
הערה: נקוט בזהירות כדי למנוע או למזער את ההשפעה על בתי גידול רגישים, אוכלוסיות צמחים וחיות בר. בנוסף, הקפידו להבטיח את כל ההרשאות ו/או ההיתרים המתאימים לבעלי הקרקע לפני הגישה לאתר ולאירועי איסוף דוגמאות. - באמצעות סמארטפון או מצלמה, צלם תמונות מפורטות של כל אתרי השטח, מיקומי איסוף הדגימות, הצמחים המארחים וכל מידע אחר שעשוי להיות רלוונטי לפרויקט. השתמש בסמארטפונים או במצלמות אחרות המתעדות קואורדינטות GPS.
הערה: יש להפעיל תיוג גיאוגרפי של תמונות בכל הטלפונים החכמים. - ערכו חיפוש מקיף בכל חלקי הצמח המארח של הזחל, כגון עלים, ניצני פרחים, פרחים או פירות מתפתחים, הידועים כפרי שנבחר על ידי הטלת ביצים בוגרות (ovipositing) (הטלת ביצים) עבור ביצים שבקעו. עבור רוב Lycaenidae, חפשו ביצים לבנות שבקעו עם חור ברור במרכז הדומה לסופגנייה שממנה הגיח הזחל היילוד (איור 3). חפשו ביצים לא מבוקעות שצבען מעט כהה יותר, לעתים קרובות ירוקות או כחלחלות, והן יהיו שלמות לחלוטין ללא חור באמצע (איור 4). השתמש בעדשת יד או במכשיר מגדלת אחר כדי לבדוק כל ביצה מקרוב.
- לאחר שנמצאה ביצה שבקעה, הניחו כפפות ניטריל על שתי הידיים.
- באמצעות מלקחיים נקיים, סטריליים ומחודדים, יש לתפוס ולמשוך בעדינות את הביצה שנבקעה מהצמח המארח ולהניח אותה ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן שמולא מראש במאגר תזה שנלקח מקופסת האחסון בת 64 הבארות.
הערה: חלק מחומרי הנשיאה של הצמחים המארחים (קטן מ-15 מ"מ קוטר) מקובלים ונורמליים במהלך האיסוף. - יש לאסוף לכל הפחות 5 דגימות לכל מדבקה/אתר של צמח מארח (שכל אחת מהן מכילה 1-20 ביצים שבקעו), תוך שאיפה ל->50 ביצים בסך הכל במיקום אם זמין.
הערה: זה יעזור להבטיח שלפחות חלק מהרקמות ייאספו בכל דגימה/מדבקה ויגדיל את הסיכויים לגילוי דנ"א (תצפית אישית). - לאחר כל איסוף ביצים, נקו בזהירות את קצות המלקחיים על ידי טבילתם בבקבוקון של 95% אתנול או על ידי טבילה עם 95% אתנול מבקבוק לחיץ או על ידי שימוש במגבונים אלכוהוליים.
הערה: זה יעזור למזער את נשיאת הרקמות בין אירועי הדגימה. - אם זמין, אספו מספר ביצים שבקעו (1-20 ביצים) ממספר צמחים באותו טלאי מארח לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד וסגרו היטב את המכסה. עבור מיני פרפרים המשתמשים במינים גדולים יותר של עושבוני או עצי פונדקאי, אספו ביצים מרובות ממקומות שונים על אותו צמח אם הכתמים המארחים מוגבלים.
הערה: צמחים נמצאים באותו טלאי מארח אם העלים שלהם נוגעים זה בזה. אם יש הפרדה פיזית ניכרת בין צמחים או טלאים, זה צריך להיחשב מדגם אחר. אם אוספים סוג רקמה אחר, כגון exuviae זחל או רגל אחת, יש להניח רק רגל אחת, שבר רגל או exuvia זחל לתוך צינור microcentrifuge (דגימה אחת לכל אדם). - ודא שכל החומר שנאסף שקוע במלואו במאגר הליזיס בתוך כל צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הקש על החלק התחתון של הצינור המדובר על משטח קשיח כדי להטביע מחדש דגימות במידת הצורך.
- נגבו את המלקחיים לייבוש בעזרת מגבון מעבדה חד פעמי נקי.
הערה: ניקוי מלקחיים זהיר חיוני כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות. - בעת איסוף דגימה חדשה, יש להשליך כפפות ניטריל משומשות ולהחליף אותן בזוג נקי.
- במחברת שדה עמידה בפני מזג אוויר, השתמשו בעיפרון או בעט לכל מזג אוויר כדי לרשום את תווית הזיהוי הייחודית שהוקצתה מצינור המיקרו-צנטריפוגה יחד עם סוג הדגימה (לדוגמה, ביצים, זחלים או רגל), המספר המשוער של הביצים שבקעו ומידע על איסוף כגון שמות אספנים, תאריך, מיקום, מיני צמחים מארחים וכל הערה נוספת (איור 2).
- החזירו את שפופרת המיקרוצנטריפוגה הסגורה עם דגימת פסולת הביצים לתיבת האחסון של מיקרוצנטריפוגה בגודל 64 בארות.
- תחזקו את קופסת האחסון של מיקרוצנטריפוגה בגודל 64 בארות בצידנית עם קרח בזמן שאתם בשטח.
- שמור את כל חומרי האיסוף האחרים בתיבת האיסוף בזמן שאתה בשטח לאחסון ושינוע בטוחים ומאוחדים בין אתרים.
4. עם השלמת איסוף השדות
- ודא שכל צינורות המיקרוצנטריפוגה המכילים דגימות נמצאים בקופסת האחסון של מיקרוצנטריפוגה בגודל 64 בארות בצידנית עם קרח להובלה.
- החזירו את כל ציוד איסוף השדה לתיבת האיסוף.
- העבר את כל הדגימות בחזרה למשרד או למעבדה ובדוק היטב כל צינור מיקרוצנטריפוגה כדי לוודא שכל חומר הדגימה שקוע לחלוטין במאגר תזה.
- הניחו את קופסת האחסון המיקרוצנטריפוגה בעלת 64 הבארות עם דגימות במקפיא עד למשלוח או לעיבוד.
הערה: מקפיא מסחרי ממוצע של -18 מעלות צלזיוס מקובל לאחסון לטווח קצר. - הערך בקפידה את כל החומרים המתכלים בארגז כלי האיסוף והחלף את כל לפי הצורך.
הערה: הדבר חשוב במיוחד אם מתוזמנים אירועי איסוף שדות מרובים. - אחסן את תיבת האיסוף במיקום מאובטח עד לאירוע איסוף השדות הבא.
- הורד את כל התמונות הדיגיטליות וודא שכולן מגובות באופן מאובטח בשרת או במערכת אחסון מבוססת ענן.
- סרוק או צלם את הדפים המקוריים של עמידות בפני מזג האוויר, עמודי מחברת שדה או גליונות נתוני שדה המכילים נתוני איסוף עד שניתן יהיה להזין את כל המידע בגיליון אלקטרוני או במסד נתונים של פרוייקט.
5. הגשת דוגמאות ונתונים
- הסר את כל קופסאות האחסון של 64 בארות microcentrifuge עם דגימות מהמקפיא.
- ארוז בקפידה את קופסאות האחסון Microcentrifuge בגודל 64 בארות עם דוגמאות ואת מחברת השדה או גיליונות נתוני השדה בתיבת משלוח רגילה, צרף את תווית המשלוח המסופקת עם מספר החשבון של השולח המקורי, ושלח באמצעות משלוח מהיר המובטח על ידי הספק, בן לילה, למחרת למנהל הפרויקט.
- שלח בדואר אלקטרוני את מספר המעקב של החבילה ועותק של עמודי המחברת או גליונות נתוני השדות שנסרקו למנהל הפרוייקט.
6. מיצוי דנ"א
- לאחר קבלת קופסאות האחסון המיקרוצנטריפוגות בעלות 64 הבארות, אחסנו אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימור הדנ"א בדגימות עד שיהיו מוכנות למיצוי DNA.
- במעבדה, חלצו דנ"א על ידי שחיקה של רקמת חרקים המאוחסנת במאגר הליזיס לאחר הפשרה מ-20 מעלות צלזיוס. הוסיפו 20 μL של פרוטאינאז K ותנו לדגימה להיספג למשך הלילה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס באינקובטור מחומם למשך לא יותר מ-24 שעות.
- הוסיפו את מאגרי הניקוי והכביסה המתאימים, בהתאם להמלצת היצרן הספציפי13.
- העבר את הדגימה התלויה במאגר לעמודת ספין המחוברת לבקבוקון אוסף של 2 מ"ל.
- סובבו ב-6,021 × גרם למשך 60 שניות באמצעות צנטריפוגה. הוסיפו את מאגרי הכביסה המתאימים וסובבו בהתאם.
- שחררו דנ"א קשור באמצעות מאגר חמקמקות (30 μL) וסובבו את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
הערה: המשך לריצוף אם ריכוז הדנ"א עולה על 0.010 ננוגרם/מ"ל. ראו איור 5 עבור ריכוז הדנ"א לפי סוג רקמה.
7. ניתוח נתונים של רצפי DNA
- חתוך או ערוך שיחות בסיס באיכות נמוכה ברצפים המתקבלים.
- שאילתות רצפים מול מאגרי מידע ציבוריים לאישור זיהוי מינים.
- יישרו רצפים זה לזה לצורך השוואה של הבדלים בין אנשים.
Representative Results
חומרים לאיסוף של עד 563 דגימות נשלחו לשמונה מדעני שימור וקהילה מתשע מדינות ברחבי טווח המינים במזרח אמריקה הצפונית. החומרים נשלחו במשך שלושה חודשים במהלך 2021 לפני שעות השיא המקומיות של הטיסות. עד כה קיבלנו בסך הכל 160 דגימות רקמת C. irus שנאספו (טבלה 1). דנ"א גנומי הופק בעקבות פרוטוקול עבור סוג דגימה זה שפורט על ידי Storer et al.14. מתוך 160 דגימות אלה, דנ"א הופק בהצלחה מ-88 עם ריכוז ממוצע של 1.67 ng/μL (SE ± 2.98), ותפוקת הדנ"א הגבוהה ביותר הייתה 26.8 ng/μL. הריכוזים כומתו באמצעות ערכת בדיקה ברגישות גבוהה לפי הוראות היצרן עם 2 μL של תמצית.
בעוד שהמספר הכולל של הדגימות המתקבלות נמוך משמעותית מזה של המספר הכולל של חומרים שנפרסו לאיסוף, זהו בעיקר תוצר של אספקת שפע יתר של חומרי איסוף לאספן הראשי או לראש הצוות כדי לאפשר להם את הגמישות המרבית לכלול אתרי איסוף מרובים ו / או מדעני קהילה מעורבים אם תרצה בכך. יתר על כן, C. iris הוא טקסון נדיר ופוחת המיוצג על ידי אוכלוסיות מוגבלות ולעתים קרובות קטנות יחסית בכל הטווח הקיים שלו. למרות אילוץ זה, המספר הכולל של דגימות הרקמה המתקבלות הוא משמעותי, במיוחד בהשוואה למה שניתן היה לצפות עם דגימה מסורתית יותר של פרפרים בוגרים בודדים.
איור 1: יחידות נפרדות הניתנות לפריסה של כל האספקה הדרושה הממתינות למשלוח למדעני הקהילה או לאנשי צוות אחרים האחראים על איסוף בשטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: יחידה נפרדת הניתנת לפריסה, הכוללת את כל הציוד, תיבת איסוף פלסטיק שקופה ותווית נושאת אקספרס שהושלמה הממתינה למשלוח למדעני הקהילה או לאנשי צוות אחרים האחראים על איסוף השטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תצלום של ביצת פרפר אלפין חלבי שבקע (Callophrys irus) על לופין בר (Lupinus perennis) מראה חור מובהק במרכז שממנו הגיח זחל היילוד. שימו לב שהצבע הכללי של הביצה שנבקעה הוא לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תמונה של ביצי פרפר אלפין חלבי (Callophrys irus) על לופין בר (Lupinus perennis). שימו לב שלביצים שלא נקטעו אין חור מרכזי בולט ושצבעם הכללי הוא ירוק כחלחל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ריכוז דנ"א לפי סוג רקמה. קווי האמצע של התיבה מייצגים את החציון, כל תיבה מרחיבה את ה- IQR, ושפם הקופסה הוא 1.5 × IQR, כאשר כל הנקודות שבחוץ הן חריגות. בדגימות שהכילו מקרה ביצה יחיד היה מקרה ביצה אחד בלבד, ובדגימות שהכילו מספר מקרי ביצה היו לפחות שני מקרים, כאשר מספר המקרים נע בין 2 ל-20 (ממוצע = 5.3) לכל דגימה. קיצור: IQR = טווח בין-קוורטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מצב | מארז ביצה | מארזי ביצים | פראס | רגל | מולט | סכום כולל |
| ארקנסו | 2 | 2 | ||||
| פלורידה | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| מישיגן | ||||||
| ניו המפשייר | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| ניו יורק | 30 | 30 | ||||
| אוהיו | ||||||
| ויסקונסין | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| אוקלהומה | 16 | 6 | 22 | |||
| סכום כולל | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
טבלה 1: מספר וסוג חומר הרקמה שנאסף לפי מדינה.
איור משלים S1: עמוד ראשון של פרוטוקול דו-צדדי, למינציה, מעובה ומאויר לשימוש בשטח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2. עמוד אחורי של פרוטוקול דו-צדדי, למינציה, מעובה ומאויר לשימוש בשטח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטת שדה לדגימת פרפרים נדירים ללא הפרעה עבור מבנה גנטי של אוכלוסייה או ניתוחי ברקוד DNA. היתרונות הכוללים של פרוטוקול זה תוכננו במיוחד כדי לסייע למקסם את היישום הרחב על ידי אנשים בעלי רמות ניסיון ומיומנות שונות כגון מדעני קהילה, אנשי שימור וסטודנטים. אלה כוללים עלות כוללת נמוכה יחסית, אספקה וציוד קלים לרכישה, שיטה פשוטה ונגישה ללא שלבים מורכבים מדי, ופריסה קלה על פני אזור גיאוגרפי רחב. בנוסף, הוא מתמקד בשאריות של חומר אורגני שמבטל את הצורך ללכוד או לתפעל באופן זמני, ותוך כדי כך עלול לפגוע באורגניזמים חיים כדי לרכוש דגימות גנטיות. יתר על כן, הוא מאריך את התקופה הפוטנציאלית הזמינה לאיסוף דגימות מעבר לפנולוגיה המסורתית או לתוחלת החיים של שלב חיים מסוים, ומשפר את הגמישות ואת הזדמנות האיסוף הכוללת כדי לעזור למקסם את מספרי הדגימה.
בעוד שהטקסון המרכזי למאמץ זה היה פרפר האלפין הקפוא, מומחה נרחב אך הולך ופוחת לבתי גידול, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן רחב יותר על חרקים רבים אחרים, כולל אלה של דאגה לשימור. באופן דומה, בעוד שהפרוטוקול מכוון לאיסוף הביצים שבקעו כמקור לחומר גנטי, ניתן להתאים אותו בקלות לדגימות אחרות, שעשויות להיות מסורתיות יותר (למשל, רגליים, שברי כנפיים, קליפסים של אנטנות) או אפילו אורגניזמים שלמים. עם זאת, היבט זה הוא גם מגבלה פוטנציאלית של הפרוטוקול. למרות שהרוב המכריע של הצעדים נועדו להיות פשוטים יחסית ומהירים לביצוע, חיפוש מקיף של טלאים של צמחים מארחים זחליים לביצי הבקיעה, שקוטרם בדרך כלל <1.0 מ"מ, דורש זמן ועבודה רבים. עם זאת, פעילות דגימה כה נרחבת היא אידיאלית במיוחד עבור רשת גדולה יותר של משתתפים כגון מדעני קהילה.
כמו בפרויקטים אחרים מבוססי שטח, הכנה מדוקדקת היא חיונית. זה כולל ניהול מלאי מלא של האספקה הדרושה כדי להבטיח שלא חסרים פריטים, כל עבודת הכנה נדרשת הושלמה, והם מאורגנים היטב, ארוזים היטב ומוכנים לפריסה בשטח. בנוסף, על כל אנשי השטח, במיוחד אלה המבצעים את איסוף הרקמות, לעיין בפרוטוקול האיסוף בפירוט לפני כל אירוע איסוף ולהפנות כל שאלה לאנשים המפקחים על הפרויקט. ברגע שנכנסים לשטח, החלק של איסוף הדגימות בפרוטוקול דורש תשומת לב קפדנית לפרטים. זה כולל איתור ובדיקה מדוקדקת של כל ביציות כדי לוודא שהן בקעו ולכן מתאימות לאיסוף, ניקוי יסודי של מלקחיים, החלפת כפפות כדי לסייע בהפחתת נשיאת רקמות בין אירועי דגימה, והבטחת דגימות רקמה שקועות לחלוטין במאגר תזה בתוך כל צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. לבסוף, תיעוד נתונים מדויקים ומפורטים הוא חיוני, הכולל קישור של תווית הזיהוי הייחודית שהוקצתה מצינור המיקרוצנטריפוגה יחד עם הדגימה הספציפית שנלקחה וכל מידע איסוף רלוונטי אחר. בעוד שצעד זה הוא שגרתי במחקר המדעי, לעתים קרובות יש להבהיר אותו ביסודיות ולחזק אותו עבור קהל מדעי קהילתי.
כאן אנו מדגימים את פוטנציאל המינוף של מדעני הקהילה לאיסוף דגימות לא-קטלניות ממינים קטנים, נדירים ומאוימים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות פוטנציאליות שיש לזכור בעת ניתוח נתונים גנטיים המתקבלים. לדוגמה, בעוד שאיגום דגימות ממדבקה אחת מגדיל את הסיכויים לשחזר מספיק דנ"א לזיהוי, הוא גם עשוי להציג הטרוזיגוטיות. בנוסף, מכיוון שהפרוטוקול כולל איסוף כוריון מביצות שבקעו, ניתן לדגום רק פרפרים נקביים, המייצגים דנ"א הורי, בתוך אוכלוסייה. עם זאת, מכיוון שלא היו נתונים גנטיים קודמים ברמת האוכלוסייה עבור C. irus, התובנות שהתקבלו יכולות רק להועיל לשימור מינים ולניהולם. לדוגמה, בעוד שתכנון מחקר יסודי ומפורט ובחירת סמנים זהירה יידרשו כדי להעריך כראוי את מבנה האוכלוסייה, פרוטוקול הדגימה המתואר כאן והשימוש בברקוד DNA של ציטוכרום c אוקסידאז תת-יחידה 1 (CO1) יכול לשמש לזיהוי התרחשות של טקסה נדירה או מסוכנת. דיון נוסף על התועלת והיישום של ריצוף DNA מדגימה לא-קטלנית המתוארת כאן מפורט על ידי Storer et. א.14.
מעבר למטרה העיקרית של איסוף דגימות לניתוח גנטי, הפרוטוקול גם מדגיש כי המשתתפים מצלמים תמונות דיגיטליות מפורטות של כל אתרי השדה, מיקומי האיסוף, הצמחים המארחים של הזחלים הנוכחים וכל מרכיב אחר של בית הגידול שמסביב שעשוי להיות רלוונטי. תיעוד כזה מסייע לספק הערכת בית גידול כללית שימושית להמחשת תנאי אתר קיימים כגון פנולוגיה של צמחים, צפיפות משאבי מארח והיסטוריית ניהול (למשל, שריפה שנקבעה לאחרונה). מידע כזה שימושי במיוחד עבור פרויקטים שבהם דגימות שדה נלקחות על פני תקופה זמנית רחבה יותר כדי לאפשר השוואות סביבתיות מפורטות יותר.
לבסוף, ככל שהירידה העולמית במספר החרקים ממשיכה להאיץ, יש צורך קריטי במאמצי הערכה וניטור מורחבים של מיניםב-15,16. השימוש במעורבות השתתפותית נרחבת יותר מצד מדענים קהילתיים, סטודנטים (למשל, מתמחים ועמיתים בשירות הדגים וחיות הבר של ארה"ב) ומטפלים בשימור מציע אפשרויות מעשיות יותר ויותר לאיסוף נתונים נרחב מסוגים רבים, כולל דגימות דנ"א. לפיכך, לנתונים המופקים מפרוטוקול זה יש שימושים אפשריים רבים. אלה כוללים סיוע בפעולות שימור מושכלות (למשל, תכנון, התאוששות וניהול), פירוט החלטות או הערכות מצב מינים, ומחקר אקולוגי, אוכלוסייה וטקסונומיה.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לדיוויד קאת'רל, אמנדה דילון, סטיב פולר, ניל גיפורד, היידי הולמן, דין ג'ו, סאלי ג'ו, דניאל קנדי, ז'נבייב קוזאק, רבקה לונגנקר, מורין מקלונג, מאט מורן, רובין ניבר, ברנדה סמית', האנטר טרוברידג' וג'סאפ וייכלט על העזרה בהיבטים שונים של הפרויקט, כולל לוגיסטיקה, תיאום, היתרים ו/או איסוף דגימות. מחקר זה מומן באמצעות מענק משירות הדגים וחיות הבר של ארה"ב (מספר זיהוי פרס פדרלי F20AC00356) המנוהל על ידי המכון לניהול חיות בר (מענק SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
