Хориоаллантоическая мембрана (CAM) птичьего эмбриона является очень полезным и применимым инструментом для различных областей исследований. Специальная ex ovo модель японского перепела CAM подходит для фотодинамического исследования лечения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хориоаллантоическая мембрана перепела - инструмент для фотодинамической диагностики и терапии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хориоаллантоическая мембрана (CAM) птичьего эмбриона представляет собой тонкую, экстраэмбриональную мембрану, которая функционирует как первичный орган дыхания. Его свойства делают его отличной экспериментальной моделью in vivo для изучения ангиогенеза, роста опухоли, систем доставки лекарств или фотодинамической диагностики (PDD) и фотодинамической терапии (PDT). В то же время эта модель отвечает требованию о замене экспериментальных животных подходящей альтернативой. Ex ovo культивируемый эмбрион обеспечивает легкое нанесение вещества, доступ, мониторинг и документирование. Наиболее часто используемым является цыпленок CAM; Однако в данной статье описываются преимущества японской перепелиной CAM как недорогой и высокопроизводительной модели. Еще одним преимуществом является более короткое эмбриональное развитие, что позволяет увеличить экспериментальную текучесть кадров. Здесь исследуется пригодность перепелиного CAM для PDD и PDT рака и микробных инфекций. В качестве примера описано применение фотосенсибилизатора гиперицина в комбинации с липопротеинами или наночастицами в качестве системы доставки. Определена оценка повреждений от изображений в белом свете и изменения интенсивности флуоресценции ткани CAM при фиолетовом свете (405 нм) совместно с анализом гистологических срезов. Перепелиный CAM четко показал влияние ФДТ на сосудистую систему и ткани. Кроме того, могут наблюдаться такие изменения, как капиллярное кровоизлияние, тромбоз, лизис мелких сосудов и кровотечение из более крупных сосудов. Японский перепел CAM является перспективной моделью in vivo для фотодинамической диагностики и исследований терапии, с применением в исследованиях опухолевого ангиогенеза, а также антиваскулярной и антимикробной терапии.
Введение
Модель куриной хориоаллантоической мембраны (CAM) хорошо известна и широко используется в различных областях исследований. Это богато васкуляризованный экстраэмбриональный орган, обеспечивающий газообмен и транспорт минералов1. Благодаря прозрачности и доступности этой мембраны отдельные кровеносные сосуды и их структурные изменения можно наблюдать в режиме реального времени2. Несмотря на преимущества, цыпленок CAM также имеет некоторые ограничения (например, более крупные селекционные мощности, производство яиц и потребление кормов), которых можно избежать, используя другие виды птиц. В этом протоколе описана альтернати....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование проводилось в соответствии с институциональными руководящими принципами. Все оборудование и реагенты должны быть автоклавированы или стерилизованы 70% этанолом или ультрафиолетовым светом.
1. Инкубация яиц
- Храните оплодотворенные перепелиные яйца при 10-15 °C максимум за 4-5 дней до начала инкубации. Используйте только чистые и неповрежденные яйца.
- Высиживать яйца в инкубаторе принудительной тяги ~ 53-54 ч. Откладывайте яйца горизонтально с выключенным вращением яиц при влажности 50-60% и температуре инкубации 37,5 °C.
2. Ex ovo культура подго....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Локализация опухоли на поверхности CAM затруднена при белом свете. Фотосенсибилизатор (здесь, гиперицин), используемый при PDD, как ожидается, будет избирательно поглощаться опухолью и помогает визуализировать опухоль. Добавление гиперицина и использование флуоресцентного света (например, 405 нм) показали, что опухоль (плоскоклеточный рак TE1) находится в очень хорошем положении (рисунок 6А). Гистологический анализ показал, что жизненно важные опухолевые клетки вторгаются в здоровые ткани. Б.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для успешного выращивания ex ovo важно следовать протоколу выше. Более того, если яйца не открыты достаточно тщательно или во время выращивания недостаточно влажности, желточный мешок прилипает к скорлупе и часто разрывается. Начало культивирования ex ovo во время около 60 ч инкубации яиц обеспечивает высокую выживаемость эмбрионов, так как они уже достаточно велики, чтобы пережить обработку. На более поздних стадиях развития CAM становится тоньше и прилипает к яичной скорлупе, что приводит к разрывам м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Работа была поддержана VEGA 2/0042/21 и APVV 20-0129. Вклад В. Хантошовой является результатом реализации проекта: Открытое научное сообщество для современных междисциплинарных исследований в области медицины (Аббревиатура: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 при поддержке Интегрированной инфраструктуры Операционной программы, финансируемой ERDF.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-луночный планшет для клеточных культур | Sarstedt | 83.392 | Прозрачный полистирол, стерильный |
| CO2 инкубатор ESCO CCL-0508 | ESCO, Сингапур | CCL-050B-8 | CO2 инкубатор для клеточных культур |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, США | ||
| цифровой фотоаппарат Canon EOS 6D II | Canon, Япония | ||
| диодный лазер 405 нм | Ocean Optics, США | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | диметилсульфоксид |
| эозин | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| этанол | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| тонкая щетка размер 2 | Faber-Castell | 281802 | щетка для разделения CAM и манипуляций |
| с глутаральдегидом | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| гематоксилин | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| гиперицин | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| инкубатор Bios Midi | Bios Sedl any, Чехия | Инкубатор с принудительной тягой для первичной инкубации | |
| инкубатор Memmert IF160 | Memmert, Германия | Инкубатор с принудительной циркуляцией воздуха для инкубации CAM | |
| Kaiser slimlite plano, светодиодный световой короб | Kaiser, | Германия 2453 | Трансиллюминатор |
| светодиодный светильник 405 нм | изготовленный на заказ круглый светодиодный свет | ||
| макрообъектив Canon MP- E 65 mm f/ 2.8 | Canon, Япония | ||
| микроскоп Kapa 2000 | Kvant, Словакия | оптический микроскоп микротом | |
| Auxilab 508 | Auxilab, Испания | ручной ротационный микротом | |
| параформальдегид | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | парафиновая среда для встраивания в ткани |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Фосфатные солевые буферные |
| ножницы Castroviejo | Orimed | OR66-108 | микроножницы для разделения CAM |
| программное обеспечение ImageJ 1.53 | общедоступная | программа обработки и анализа изображений | |
| стоковое решение HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | липопротеины высокой плотности |
| стоковый раствор LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | липопротеины низкой плотности |
| Ткань-Tek O.C.T. Соединение | Sakura Finetek | 4583 | Оптимальная температура резки Компаунд 118 мл для отжимных бутылок |
Ссылки
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
