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オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

DOI:

10.3791/63458

⸱

June 3rd, 2022

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1Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of Education of China, Yangzhou University, 2Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province, College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, 3Animal & Avian Sciences, University of Maryland, College Park, 4College of Biotechnology, Jiangsu University of Science and Technology

In This Article

Summary

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この論文の全体的な目標は、ニワトリ胚への外因性物質の卵管細胞内注入 において どのように行うかを記述することである。このアプローチは、ニワトリ胚の発生生物学を研究するのに非常に有用である。

Abstract

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胚生物学の古典的なモデルシステムとして、ニワトリ胚は胚の発生と分化を調べるために使用されてきた。外因性物質をニワトリ胚に送達することは、胚発生中の遺伝子機能、トランスジェニック育種、およびキメラ調製を研究する上で大きな利点を有する。ここでは、プラスミドベクターや改変始原生殖細胞(PGC)などの外因性物質を発生初期の段階でドナーニワトリ胚に移入することができる in ovo 血管内注射の方法を示す。結果は、背側大動脈および頭部を介した血管内注射が、注入された物質が血液循環系を介して胚全体に拡散することを可能にすることを示している。提示されたプロトコールにおいて、外因性プラスミドおよびレンチウイルスベクター導入の有効性、ならびにレシピエント生殖巣における注射された外因性PGCのコロニー形成を、胚における蛍光を観察することによって決定した。この記事では、この方法の詳細な手順を説明し、それによって遺伝子機能、胚および発生生物学、および生殖腺キメラニワトリ産生を研究するための優れたアプローチを提供する。結論として、この記事は、研究者が大きな成功と再現性でニワトリ胚への外因性物質の 卵管 内注射を行うことを可能にします。

Introduction

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ニワトリ胚は、発生学的、免疫学的、病理学的、および他の生物学的用途において何世紀にもわたって広く使用されてきた1,2,3。それらは、毒物学および細胞生物学の研究において、他の動物モデルよりも多くの固有の利点を有する4。ニワトリの胚は簡単にアクセスでき、インビトロで操作し、任意の発生段階で直接観察することができ、便利な胚研究モデルシステムを提供します。

一般に、エレクトロトランスフェクションや胚腔下注射などの現在のニワトリ胚送達方法は、専門機器や設計されたプログラムの要件、卵黄や卵白の存在による非効率性などの制限があります5,6,7。ここでは、外因性物質をニワトリ胚に送達するための簡単で効率的な取り扱い方法を示す。これは、発生生物学の研究に使用される強力なツールとなり得ます。注入された物質は、血液循環を介して胚全体に広がる。ニワトリ胚の初期発生の間、PGCは血液中を移動し、生殖器隆起に定着し、配偶子に発達し、外因

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Protocol

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動物の世話と使用に関するすべての手順は、米国国立衛生研究所のガイドライン(NIH Pub. No. 85-23、1996年改訂)に準拠し、ニワトリ胚プロトコルは、中国揚州大学の実験動物管理および実験動物倫理委員会(No.201803124)によって承認されました。

1. 受精卵の採取と準備

注:哺乳類とは異なり、鶏肉は単一の卵巣に何百万もの卵胞を持っていますが、これらの卵胞のほんの一部だけが排卵するのに十分成熟しています。各卵胞は1つの卵母細胞または生殖細胞を含む。卵胞が成熟して卵黄を放出するとすぐに、卵管の漏斗に取り込まれます。卵胞が卵管の頸部腹部に入ると、精液が鶏の体内の卵に結合し、鶏の体内のカルシウムが受精卵を包む殻を形成し、体内に柔らかい殻の卵を形成します。カルシウムの殻は、卵が生産されるまで徐々に厚くなります。

  1. 受精卵を地元の業者や機関から集め、16°Cで1週間保存することができます。
    注:高い保存温度は胚の発達を助け、低温は胚の生存率を低下させる。胚は、保存時間が長すぎると発達しない。
  2. 卵をインキュベーターに移す前に、卵殻を75%エタノールで柔らかくゆっくりとこすります。
  3. 卵を横向きに、37.8°C、湿度60%のインキュベーター内のラックにきれいに置きます。60時間のインキュベーション(HHステージ17)の後、....

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Results

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ここではニワトリ胚の 卵 管内注射を示す。血管内注射の概略プロセスを 図1に示す。私たちの研究では、注射をテストおよび検証するためにさまざまな外因性溶液を使用しました。

注入された材料をよりよく視覚化するために、トリパンブルー(0.4%)をトレーサーとして胚に注入した。トレーサー(青色)は、背側大動脈または頭部注射のいずれかによって血液循環 を介して 胚全体に拡散することが観察された(図2)。2つの異なる部位に注入された物質は、胚全体に広がることができ、血液循環を介した拡散を示す。青色の視覚化は、注射の成功を確認する。

pEGFP-N1ベクターをPEIで包んで1μg/μLの濃度を達成し、レンチウイルスベクターpLVX-EGFPをPEIで包み、滴定後に希釈してウイルス濃度5 x106 Tu/μLを達成した。5日目(HHステージ24)において、胚を立体蛍光.......

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Discussion

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ニワトリ胚のin ovo血管内注射の方法は、外因性物質(ベクター、ウイルス性、またはPGC)が胚に移植されるように最適化される。この手法に基づき、安定した遺伝子過剰発現または干渉(SpinZ、JUN、UBE2Iなど)を有するニワトリ胚モデルを構築した。17,18,19。これらの確立されたモデルは、このアプローチの実現可能性を証明しています。さらに、我々は単離されたPGCをレシピエントの胚生殖巣に移植しただけでなく、誘導PGCを移植した胚生殖腺で生存可能な子孫を産生することに成功し、これは将来この方法の壮大な適用を意味する20。

この方法の重要なステップは、注射である。外因性物質は、深すぎたり浅すぎたりせず、血管に直接注入する必要があります。したがって、ニワトリの胚を扱う経験と、練習を通じて容易に得ることができる高い注入技術が必要です.......

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Disclosures

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利益相反は宣言されませんでした。

Acknowledgements

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この研究は、中国国家自然科学財団(31972547)の支援を受けた。Jing Wangによるコピーエディットと、米国ワシントン州立大学のMalik Donlicによるナレーションに感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
蛍光マクロ顕微鏡オリンパスMVX10
ガラス毛細血管成重G1
リポフェクタミン 2000Invitrogen12566014リポソーム
pEGFP-N1 ベクターClontech#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit シグマPKH26GL
pLVX-EGFP レンチウイルスベクターAddgene128652
空気圧マイクロインジェクター成重IM-11-2
プーラー成重PC-100
トリパン ブルーステインGibco15250061

References

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  1. Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).
  2. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (....

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