Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

Nadezhda Podoplelova; Polina Soloveva; Andrei Garzon Dasgupta; Aleksandra Filkova; Mikhail Panteleev

doi:10.3791/63459

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Articolo metodologico

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

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DOI:

10.3791/63459

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6 aprile 2022

Nadezhda Podoplelova¹^,² , Polina Soloveva¹^,⁴ , Andrei Garzon Dasgupta¹^,²^,³ , Aleksandra Filkova¹^,² , Mikhail Panteleev¹^,²^,³^,⁴

¹Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, ²National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, ³Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, ⁴Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Abstract

Nel corpo umano, la maggior parte delle principali reazioni fisiologiche coinvolte nella risposta immunitaria e nella coagulazione del sangue procedono sulle membrane delle cellule. Un primo passo importante in qualsiasi reazione dipendente dalla membrana è il legame delle proteine sulla membrana fosfolipidica. Un approccio allo studio dell'interazione proteica con le membrane lipidiche è stato sviluppato utilizzando proteine marcate fluorescentemente e citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio delle interazioni proteina-membrana utilizzando cellule vive e vescicole fosfolipidiche naturali o artificiali. Il vantaggio di questo metodo è la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. In questo metodo, le proteine sono etichettate utilizzando coloranti fluorescenti. Tuttavia, possono essere utilizzate sia proteine autoprodotte che disponibili in commercio, etichettate in modo fluorescente. Dopo la coniugazione con un colorante fluorescente, le proteine vengono incubate con una fonte della membrana fosfolipidica (microvescicole o cellule) e i campioni vengono analizzati mediante citometria a flusso. I dati ottenuti possono essere utilizzati per calcolare le costanti cinetiche e l'equilibrio K_d. Inoltre, è possibile stimare il numero approssimativo di siti di legame proteico sulla membrana fosfolipidica utilizzando speciali perle di calibrazione.

Introduzione

Le biomembrane separano il contenuto interno delle cellule animali e lo spazio extracellulare. Si noti che le membrane circondano anche le microvescicole formate durante il ciclo di vita della cellula e gli organelli. La membrana cellulare è prevalentemente composta da lipidi e proteine. Le proteine di membrana svolgono funzioni di segnalazione, strutturali, di trasporto e adesive. Tuttavia, il doppio strato lipidico è anche essenziale per l'interrelazione della cellula animale con lo spazio extracellulare. Questo documento propone un metodo per studiare l'interazione periferica delle proteine esterne con la membrana lipidica.

L'esempio più....