Протокол представляет общие лабораторные процедуры, необходимые для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию на основе полупроводниковой платформы секвенирования следующего поколения. Здесь мы представляем подробные этапы амплификации всего генома, выбора фрагментов ДНК, построения библиотеки, подготовки шаблонов и секвенирования рабочего потока с репрезентативными результатами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Предимплантационное генетическое тестирование анеуплоидии на платформе секвенирования следующего поколения на основе полупроводников
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Секвенирование следующего поколения приобретает все большее значение в клиническом применении при определении генетических вариантов. В предимплантационном генетическом тесте этот метод имеет свои уникальные преимущества в масштабируемости, пропускной способности и стоимости. Для предимплантационного генетического теста для анализа анеуплоидии представленная здесь полупроводниковая система секвенирования следующего поколения (NGS) обеспечивает комплексный подход к определению структурных генетических вариантов с минимальным разрешением 8 Мб. От получения образца до окончательного отчета рабочий процесс требует нескольких этапов с строгим соблюдением протоколов. Поскольку различные критические шаги могут определять результат усиления, качество библиотеки, охват чтения и вывод данных, описательная информация с визуальной демонстрацией, отличной от слов, может предложить более подробную информацию об операции и манипуляции, что может оказать большое влияние на результаты всех критических шагов. Способы, представленные в настоящем описании, будут отображать процедуры, участвующие в амплификации всего генома (WGA) биопсий клеток трофэктодермы (TE), построении геномной библиотеки, управлении секвенсорами и, наконец, генерации отчетов о вариантах номеров копий.
Введение
Анеуплоидия — это аномалия в количестве хромосом при наличии одной или нескольких лишних хромосом или отсутствии одной или нескольких хромосом. Эмбрионы, которые несут некоторый тип анеуплоидии, такой как потеря одной Х-хромосомы (синдром Тернера), дополнительные копии аутосом, таких как трисомы аутосомы 21 (синдром Дауна), 13 (синдром Патау) и 18 (синдром Эдвардса), или дополнительные половые хромосомы, такие как 47, XXY (синдром Клайнфельтера) и 47, XXX (синдром Тройного X), могут дожить до срока с врожденными дефектами1. Анеуплоидия является основной причиной выкидышей в первом триместре и неудачи экстракорпорального оплодотворения ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы и биопсия трофэктодермы (TE) (раздел 1.1.1.1), примененные в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены комитетом по этике исследований человека больницы No 924 18 сентября 2017 года (NO: PLA924-2017-59). Пациенты/участники предоставили свое письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.
1. Выделение ДНК из биопсии эмбриона человека и цельная геномная амплификация
- Протокол амплификации всего генома 9,10
ПРИМЕЧАНИЕ: Pico PLEX WGA Kit используется для выполнения амплификации всего генома.- Сбор и хранение образ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Поскольку план последовательностей завершается после запуска процесса на машине, система сервера последовательностей сообщает сводку с описательной информацией о сгенерированных данных, состоянии чипа, скорости загрузки ISP и качестве библиотеки, как показано на рисунке 2. В этой демонстрации результатов было получено 17,6 G данных в общей базе, а общая скорость загрузки ISP составила 88% в общих скважинах чипа; тепловая карта показала, что образец был равномерно загружен на общую площадь чи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хромосомная анеуплоидия эмбрионов является причиной большой доли потери беременности, будь то естественное оплодотворение или экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). В клинической практике ЭКО предполагается, что скрининг анеуплоидии эмбриона и перенос эмбриона эуплоидии может улучшить исход ЭКО. Флуоресцентная гибридизация in situ является самым ранним методом, принятым для выбора пола и PGT-A; однако этот метод требует большей технической экспертизы со стороны лабораторного персонала и является относ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Чжанъюн Мина и г-на Жунцзи Хоу за их советы по расширенному применению LIMS. Это исследование поддерживается Специальными исследовательскими проектами НОАК по планированию семьи (17JS008, 20JSZ08), Фондом Гуансийской ключевой лаборатории исследований метаболических заболеваний (No 20-065-76) и Научно-техническим исследовательским проектом гражданского здравоохранения Гуанчжоу (201803010034).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,45 мкм; m Шприцевой фильтрующий блок | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1,5 мл DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 мл | Tubes Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2,0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 мл | Tubes Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (mg2+ Plus) | ФАПОН | ||
| Реагент Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP (магнитные шарики для связывания ДНК) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell Lysis buffer, содержащий 40 мМ Tris (pH 8), 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 мМ натрия пирофосфат, 2 мМ β-глицерофосфат, 0,1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| буфер для элюирования ДНК | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Этиловый спирт | Гуанчжоу Завод химических реактивов Thermo Fisher Научные | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Независимо разработанные реактивы для амплификации всего генома | Южный медицинский университет | Реагенты состоят из следующих компонентов: 1. Лизис клеток 2. Амплификация Предварительно смешанный раствор 1) Грунтовка WGA-P2 (10 μ M) 2) dNTP (10 мМ) 3) 5x Анстарт Так Буфер (мг<суп>2+ плюс)<бр/> 3. Фермент амплификации 1) ДНК-полимераза Anstart Tap (5 U/μ L) | |
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit, упомянутый в шаге 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ионная протонная система | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| изопропанол | Фабрика химических реактивов Гуанчжоу | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Набор для подготовки библиотеки | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Нуклеаза Без Воды | Life Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNN NNNNATGTGG-3'OneTouch | |
| 2 System | Life Technologies | 4474779 | Шаблонная система амплификации и обогащения |
| ПЦР-пробирок | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio США | R300671 | |
| Наконечники для пипеток | Качественная научная продукция | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Портативная мини центрифуга LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Флуориметр | Life Technologies | Q33216 | Флуориметр |
| Пробирки для анализа кубитов | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Секвенатор серверная система | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Программное обеспечение | |
| для секвенирования реакций Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html<чел./> Данный комплект содержит следующие компоненты:<бр/> 1. Набор для подготовки шаблонов 1.1 Набор для подготовки шаблонов: Эмульсионный буфер для ПЦР Эмульсионная смесь ферментов для ПЦР Раствор для носителя шаблона 1.2 Растворы для подготовки шаблонов: Реакционное масло для приготовления шаблона I раствор для разрушения эмульгатора II Реакционное масло для приготовления шаблона II Вода без нуклеазы Tween раствор Раствор для деэмульгирования I Раствор для промывки шаблона Раствор для промывки шариков C1 Раствор для ресуспензии шариков C1 Раствор для ресуспензии шаблона 1.3 Материалы для подготовки шаблона: Пробирка с реагентом I соединитель Трубка для сбора реагентов Пипетка для реагентной трубки I Амплификационная пластина 8 лунок strip Специальные наконечники Адаптер для мойки подготовки шаблона Фильтр для подготовки шаблона 2. Набор для секвенирования 2.1 Набор для секвенирования: dGTP dCTP dATP dTTP Секвенирование ферментного раствора Секвенирование праймеров Шаблоны контроля качества 2.2 Решения для секвенирования: Раствор для секвенирования II Раствор для секвенирования IIIi Буфер для отжига Загрузочный буфер Пенообразователь Таблетки хлора C1 шарик 2.3 Материалы для секвенирования: Пробирка с реагентом II Крышка пробирки с реагентом Трубка с реагентом II Бутылка с реагентом Бутылка с реагентом 3. Чип |
| Раствор гидроксида натрия | Sigma | 72068-100ML | |
| Термоамплификатор | Life Technologies | 4375786 |
Ссылки
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
