В этой рукописи субконъюнктивальная инъекция демонстрируется как действительный векторный метод доставки для глазных тканей у мышей с использованием системы инъекций, состоящей из инфузионно-выводного шприцевого насоса и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Эта система инъекций также адаптируется для других внутриглазных путей введения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Субконъюнктивальное введение аденоассоциированных вирусных векторов в моделях мелких животных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Глазные заболевания включают в себя широкий спектр наследственных генетических и приобретенных расстройств, которые являются привлекательными целями для местной доставки лекарств из-за их относительной легкости доступа через несколько способов введения. Субконъюнктивальные (SCJ) инъекции предлагают преимущества по сравнению с другими путями внутриглазного введения, поскольку они просты, безопасны и обычно выполняются в амбулаторных условиях. Инъекции SCJ мелким животным обычно требуют помощи операционного микроскопа из-за размера глаза. Предыдущая работа показала, что инъекция SCJ специфических серотипов аденоассоциированного вируса (AAV) является действительной стратегией доставки генов для целенаправленной трансдукции глазной поверхности, глазной мышцы, роговицы и зрительного нерва, обеспечивая потенциальный подход к лечению многих глазных заболеваний.
В настоящем документе представлен подробный протокол для инъекций SCJ в мышиной модели с использованием системы впрыска, состоящей из программируемого инфузионно-выводного шприцевого насоса (который обеспечивает постоянную и точную скорость и давление впрыска) и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Система инъекций также адаптируется для других внутриглазных путей введения, таких как интрастромальные, внутрикамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции у мелких животных. Хотя описана доставка аденоассоциированных вирусных векторов для исследований глазной генной терапии, протокол в настоящем описании также может быть адаптирован для различных офтальмологических растворов на моделях мелких животных. Будут подробно рассмотрены ключевые практические шаги в пути введения, настройка для инъекционной платформы, подготовка инъекции и советы из непосредственного опыта. Кроме того, будут кратко обсуждены общие методы валидации для подтверждения доставки AAV в желаемые ткани.
Введение
Глазные заболевания охватывают широкий спектр как генетических, так и приобретенных расстройств. По оценкам, в 2015 году 36 миллионов человек во всем мире были юридически слепыми, и более 1 миллиарда человек страдают, по крайней мере, от некоторого уровня нарушений зрения, что подчеркивает необходимость наращивания усилий по смягчению последствий на всех уровнях1. Основные методы доставки глазных препаратов включают как местное, так и местное введение, такое как глазные капли или субконъюнктивальные (SCJ), внутрикамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции. Хотя неинвазивная местная терапия является наиболее распространенным методом дос....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с правилами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл. Использование переносчиков AAV представляет собой риск биологической опасности уровня биобезопасности 1. Носите надлежащие средства индивидуальной защиты, включая лабораторное пальто, перчатки и очки при обращении с AAV. Для эксперимента, описанного в настоящем описании, использовали рекомбинантный вектор AAV, упакованный с капсидом серотипа 8 и кодирующий общий вездесущий промотор цитомегаловируса (ЦМВ), контролирующий экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Раствор, вводимый в субконъюнктивальное пространство, представляет собой блеб в зависимости от объема инъекции.
В этом эксперименте 7 мкл AAV (7 × 109 вирусных геномов (vg)/глаз), смешанных с флуоресцеином в конечной концентрации 0,1%, вводили иглой 36 G под стереомикроскопом, а скорость/давление инъекции поддерживали постоянной с помощью программируемого шприцевого насоса со скоростью 1 мкл/с. Блеб может появиться при инъекции (стрелка). Микроскопическое представление введения вектора AAV .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
AAV-опосредованная генная терапия обладает большим потенциалом для лечения глазных заболеваний. Современная глазная генная терапия опирается на два основных пути местного введения: интравитреальные и субретинальные инъекции. К сожалению, оба пути являются инвазивными и могут вызвать серьезные осложнения, включая отслоение сетчатки, образование катаракты и эндофтальмит. Таким образом, большой интерес представляет исследование относительно менее инвазивных путей, таких как инъекция SCJ.
Хотя это.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Авторы благодарят Vector Core в Университете Северной Каролины за предоставление векторов scAAV8-GFP, используемых в этом исследовании, CGIBD Histology Core и лаборатории доктора Брайана С. Гилгера за их помощь в аспектах клинической оценки этого исследования. Это исследование было поддержано Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship и премией за развитие карьеры от Американского общества генной и клеточной терапии и Фонда муковисцидоза. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Американского общества генной и клеточной терапии или Фонда муковисцидоза.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Иглы 36 G NanoFil | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV вектор | Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл | nbsp; / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| антитело против GFP | AVES labs Inc. | ||
| Цифровой фотоаппарат | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| набор для экстракции ДНК/РНК | Qiagen | 80204 | |
| Щипцы | Fine Science Tools | F6521 | |
| Шприц Hamilton | Hamilton | 7654-01 | |
| Индийские чернила | StatLab | NC9903975 | |
| раствор для инъекций кетамина гидрохлорида | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Влагостойкая пленка | Parafilm | 807-6 | |
| Полиэтиленовая трубка | Becton Dickinson и компания | 427401 | |
| Пропаракаин 0,1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Отскочной тонометр | Тоновет | / | |
| Раствор флуоресцеина | натрия Sigma-Aldich | 46960 | |
| Стандартный насос для ввода/вывода 11 Pico Plus Elite Программируемый шприцевой насос | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Стереомикроскопия | Leica | Mz6 | |
| Тетракаина гидрохлорид офтальмологический раствор 0,5% | Bausch and Lomb | Rx только | |
| мазь для местного применения | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Ксилазин | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Фенол Красная нить Коробка 100 нитей | ZONE-QUICK | PO6448 |
Ссылки
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
