耐药性药物病例的不断增加 白色念珠菌 是一个全球性的严重健康问题。抗菌光动力疗法（aPDT）可能为对抗耐药性真菌感染提供一种策略。本方案描述了玫瑰红介导的aPDT对多重耐药真菌的治疗效果 C. albicans 菌株 体外.
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摘要
摘要
侵袭性Candida albicans感染是人类重要的机会性真菌感染，因为该菌是肠道、口腔、阴道和皮肤最常见的定植微生物之一。尽管已有抗真菌药物可用，侵袭性念珠菌病的死亡率仍约为50%。不幸的是，全球范围内耐药C. albicans的发病率正在上升。抗菌光动力疗法（aPDT）可能为抑制C. albicans生物膜形成及克服耐药性提供一种替代或辅助治疗手段。以玫瑰红（RB）介导的aPDT已被证明可有效杀灭细菌和C. albicans。本研究描述了RB-aPDT对多重耐药C. albicans的作用效果。设计了一种自制的绿色发光二极管（LED）光源，使其与96孔板中某一孔的中心对齐。将酵母菌在不同浓度RB条件下于孔板中孵育，并以不同能量密度的绿光照射。通过平板稀释法分析杀菌效果。在光与RB的最佳组合下，实现了3个对数级的生长抑制。研究得出结论：RB-aPDT可能有效抑制耐药性C. albicans。
引言
C. albicans 在健康个体的胃肠道和泌尿生殖道中定植，约50%的个体可检测到其作为正常微生物群存在1如果宿主与病原体之间出现失衡， C. albicans 能够侵入并引发疾病。感染可从局部黏膜感染发展至多器官衰竭2在美国一项多中心监测研究中，2009年至2017年间，约一半侵袭性念珠菌病患者的分离株为 C. albicans3念珠菌血症可能与较高的发病率、死亡率以及住院时间延长相关4美国疾病控制与预防中心报告称，约有7%的念珠菌血样检测对抗真菌药物氟康唑耐药。5. 耐药性药物的出现 假丝酵母 这一物种引发了人们对开发抗真菌药物的替代疗法或辅助疗法的担忧。
抗菌光动力疗法（aPDT）通过在光敏剂（PS）最大吸收波长处的光照来激活特定的光敏剂6。激发后，激发态的光敏剂将其能量或电子转移给邻近的氧分子，并回到基态。在此过程中，会产生活性氧和单线态氧，从而导致细胞损伤。自20世纪90年代以来，aPDT已被广泛用于杀灭微生物7。aPDT的优势之一是在照射过程中，单线态氧和/或活....
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方案
1. aPDT 系统的准备
- 从LED灯带（见材料表）上剪下四个绿色发光二极管（LED），并将其与96孔板的四个孔对齐（图1）。
注意：LED被排列成4×3阵列。LED背面粘附于散热片上，以在照射过程中散发热量。 - 使用光功率计在540 nm处测量LED的辐照度（fluence rate）11（见材料表）。参见补充图1，以确保LED的辐照度波长范围在510–560 nm之间。
- 照射过程中，在培养板旁放置一台电风扇，以维持恒定温度（25 ± 1 °C）11。参见补充图2，以确保照射期间培养基温度保持恒定。
2. 酵母形态的培养 C. albicans
注意：实验中使用了一株对大多数抗真菌药物（包括氟康唑）具有耐药性的多重耐药白色念珠菌（C. albicans）（BCRC 21538/ATCC 10231）16
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结果
图1展示了本研究中使用的aPDT系统。由于高温可能导致显著的细胞死亡，因此在照射过程中使用电风扇对LED阵列进行冷却，并使用散热片以维持温度恒定在25 ± 1 °C。由此可排除热效应的影响。均匀的光照分布也是成功实施aPDT的重要决定因素；因此，在照射期间必须精确地将LED灯泡与孔板孔位对齐。由于LED亮度较高，在开启光源前需佩戴太阳镜。
C. albicans 经RB染色后立即在荧光显微镜下观察到红色荧光（图2中0分钟）。可见RB以时间依赖性方式进入细胞（图2）。本研究采用15分钟的RB孵育时间，此时大多数细胞已被RB染色。较高的RB浓度可产生更强的荧光，从而生成更多自由基以杀灭真菌。然而，它也可能导致正常细胞显著死亡；因此，临床上通常使用0.2%的RB浓度。本研究即选用该确切浓度。
光动力疗法（PDT）涉及利用光照激活玫瑰红（RB）。当.......
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讨论
近期已有关于玫瑰红光动力疗法（RB-PDT）在真菌性角膜炎临床应用中取得良好效果的报道19。玫瑰红（RB）的吸收峰位于450–650 nm。为确保aPDT成功实施，确定光源的辐照度至关重要。治疗癌细胞通常需要较高的能量密度（一般>100 J/cm2），而治疗感染性病灶则预期使用较低的能量密度6。高能量密度意味着较长的照射时间，在临床实践中可能不具可行性。在治疗真菌性角膜炎时，眼科领域普遍认可的能量密度为5.4 J/cm220。此外，玫瑰红过长的孵育时间也不利于患者接受aPDT治疗。因此，后续实验选择15分钟作为孵育时间。
某些步骤对于实验的成功至关重要。用于真菌培养的琼脂平板在开启风扇的层流罩中干燥15-20分钟，以减少表面水分。若表面潮湿，真菌液滴会流动并相互混合，从而阻止单菌落的形成。
所有实验均需在弱光条件下进行，以防止玫瑰红B.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了中国台湾教育部（MOE）高等教育深耕计划特色领域研究中心项目以及中国台湾科技部资助的国立成功大学应用奈米医学中心的资助 [MOST 109-2327-B-006-005]，资助对象为 TW Wong。J.H. Hung 感谢来自中国台湾国立成功大学医院 [NCKUH-11006018] 及 [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] 的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Neptune，美国加利福尼亚州圣迭戈 | #3745.x | |
| 带细胞筛网帽的5 mL圆底管 | Falcon，美国 | #352235 | |
| 96孔板 | 中国台湾桃园县Alpha plus | #16196 | |
| 铝箔 | 中国台湾台南 | ||
| 铝制散热片 | Nanyi electronics Co., Ltd.，中国台湾台南 | BK-T220-0051-01 | 散去LED阵列产生的热量。 |
| 离心 | 德国艾本多夫公司，英国 | 5415R | |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad 8.0，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 绘图与统计分析软件 | |
| 绿色发光二极管（LED）灯带 | Nanyi electronics Co., Ltd.，台南，中国台湾 | 2835 | 发射峰波长：525 nm，视角：150°°；源自 https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| 培养箱 | Yihder，中国台湾台北 | LM-570D (R) | |
| 光功率计 | Ophir，耶路撒冷，以色列 | PD300-3W-V1-传感器 | |
| Millex 0.22 μm 滤膜 | 美国新泽西州默克公司 | SLGVR33RS | |
| 耐多药白色念珠菌 | 生物资源收集与研究中心，中国台湾新竹 | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| 光密度600 分光光度计 | Biochrom，英国伦敦 | Ultrospec 10 | |
| 玫瑰红素 | Sigma-Aldrich，密苏里州，美国 | 330000 | 储存浓度 40 mg/mL = 4%，用 PBS 配制，4 ℃ 保存 °C |
| 无菌玻璃管 | Sunmei Co., Ltd.，中国台湾台南 | AK45048-16100 | |
| 酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基 | 印度 HIMEDIA | M1363 |
参考文献
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al.
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重印与许可
