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方法文章

玫瑰红介导的光动力疗法以抑制 白色念珠菌

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DOI：

10.3791/63558

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2022年3月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Department of Dermatology, Fu Jen Catholic University Hospital, Fu Jen Catholic University, 6Institute of Clinical Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7School of Medicine, National Cheng Kung University, 8Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 9Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

耐药性药物病例的不断增加 白色念珠菌 是一个全球性的严重健康问题。抗菌光动力疗法（aPDT）可能为对抗耐药性真菌感染提供一种策略。本方案描述了玫瑰红介导的aPDT对多重耐药真菌的治疗效果 C. albicans 菌株 体外.

摘要

侵袭性Candida albicans感染是人类重要的机会性真菌感染，因为该菌是肠道、口腔、阴道和皮肤最常见的定植微生物之一。尽管已有抗真菌药物可用，侵袭性念珠菌病的死亡率仍约为50%。不幸的是，全球范围内耐药C. albicans的发病率正在上升。抗菌光动力疗法（aPDT）可能为抑制C. albicans生物膜形成及克服耐药性提供一种替代或辅助治疗手段。以玫瑰红（RB）介导的aPDT已被证明可有效杀灭细菌和C. albicans。本研究描述了RB-aPDT对多重耐药C. albicans的作用效果。设计了一种自制的绿色发光二极管（LED）光源，使其与96孔板中某一孔的中心对齐。将酵母菌在不同浓度RB条件下于孔板中孵育，并以不同能量密度的绿光照射。通过平板稀释法分析杀菌效果。在光与RB的最佳组合下，实现了3个对数级的生长抑制。研究得出结论：RB-aPDT可能有效抑制耐药性C. albicans。

引言

C. albicans 在健康个体的胃肠道和泌尿生殖道中定植，约50%的个体可检测到其作为正常微生物群存在1如果宿主与病原体之间出现失衡， C. albicans 能够侵入并引发疾病。感染可从局部黏膜感染发展至多器官衰竭2在美国一项多中心监测研究中，2009年至2017年间，约一半侵袭性念珠菌病患者的分离株为 C. albicans3念珠菌血症可能与较高的发病率、死亡率以及住院时间延长相关4美国疾病控制与预防中心报告称，约有7%的念珠菌血样检测对抗真菌药物氟康唑耐药。5. 耐药性药物的出现 假丝酵母 这一物种引发了人们对开发抗真菌药物的替代疗法或辅助疗法的担忧。

抗菌光动力疗法（aPDT）通过在光敏剂（PS）最大吸收波长处的光照来激活特定的光敏剂6。激发后，激发态的光敏剂将其能量或电子转移给邻近的氧分子，并回到基态。在此过程中，会产生活性氧和单线态氧，从而导致细胞损伤。自20世纪90年代以来，aPDT已被广泛用于杀灭微生物7。aPDT的优势之一是在照射过程中，单线态氧和/或活性氧（ROS）可同时损伤细胞内的多个细胞器；因此，迄今为止尚未发现对aPDT产生耐受性的现象。此外，最近一项研究报道，经aPDT处理后仍存活的细菌对抗生素的敏感性反而增强8。

用于 aPDT 的光源包括激光、带滤光片的金属卤化物灯、近红外光和发光二极管（LED）9,10,11,12。激光可提供较高的光功率，通常大于 0.5 W/cm2，可在极短时间内输送高剂量的光。在治疗时间较长不便利的情况下（例如口腔感染的 aPDT），激光已被广泛应用。激光的缺点是其照明光斑较小，使用扩散器时范围仅为几百微米至 10 mm。此外，激光设备价格昂贵，且需要专门培训才能操作。相比之下，带滤光片的金属卤化物灯的照射面积相对较大13。然而，该灯具过于笨重且成本高。在皮肤科领域，LED 光源已成为 aPDT 的主流，因其体积小且成本较低。通过 LED 灯珠的阵列排布，可实现相对较大的照射面积，甚至可同时照射整个面部9。然而，目前大多数（即使不是全部）商用 LED 光源均针对临床应用设计，可能因占用空间大且价格高而不适用于实验室实验。我们开发了一种低成本的 LED 阵列，体积非常小，可通过裁剪和组装 LED 灯带制成。LED 可根据不同实验设计进行灵活排布，可在一次实验中于 96 孔板甚至 384 孔板中完成多种 aPDT 条件的处理。

玫瑰红（Rose bengal，RB）是一种有色染料，广泛用于增强人眼角膜损伤的可视化14。RB介导的抗菌光动力疗法（aPDT）对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和白念珠菌（C. albicans）具有杀灭作用，其效率与亚甲蓝O（Toluidine blue O）大致相当15。本研究展示了一种验证RB-aPDT对耐多药白念珠菌（C. albicans）作用效果的方法。

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方案

1. aPDT 系统的准备

  1. 从LED灯带（见材料表）上剪下四个绿色发光二极管（LED），并将其与96孔板的四个孔对齐（图1）。
    注意：LED被排列成4×3阵列。LED背面粘附于散热片上，以在照射过程中散发热量。
  2. 使用光功率计在540 nm处测量LED的辐照度（fluence rate）11（见材料表）。参见补充图1，以确保LED的辐照度波长范围在510–560 nm之间。
  3. 照射过程中，在培养板旁放置一台电风扇，以维持恒定温度（25 ± 1 °C）11。参见补充图2，以确保照射期间培养基温度保持恒定。

2. 酵母形态的培养  C. albicans

注意：实验中使用了一株对大多数抗真菌药物（包括氟康唑）具有耐药性的多重耐药白色念珠菌（C. albicans）（BCRC 21538/ATCC 10231）16。

  1. 采用纸片扩散法测定抗真菌药物敏感性，参照先前已发表的报告17。
  2. 根据微生态环境的不同，使C. albicans生长为酵母、菌丝和假菌丝形态18。
    ​注意：菌丝和假菌丝形态难以进行准确定量。酵母形态可在显微镜下或通过流式细胞术精确计数。细胞生长过程中的温度决定其形态。在室温（25 °C）下，几乎所有细胞均为酵母形态。将C. albicans在30 °C下短时间培养4小时，不会影响其酵母形态。

3. 浮游态的 aPDT  C. albicans

  1. 用无菌接种环从琼脂平板上挑取一株 C. albicans 单菌落，接种至已灭菌的玻璃试管中，加入 3 mL 酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（见材料表）。
    1. 将试管置于 25 ± 1 °C 条件下，在转速为 155 rpm 的摇床中培养过夜（14–16 小时），以扩增 C. albicans 并维持其酵母形态，便于准确计数。
  2. 将过夜培养物用培养基稀释至 30 °C 下 OD600 值约为 0.5，并在 155 rpm 转速下继续振荡培养 4 小时，使 C. albicans 达到对数生长期。
  3. 再次用新鲜 YPD 培养基将对数期培养物稀释至 OD600 值为 0.65（约 1 × 107 菌落形成单位，CFU/mL）。通过在琼脂平板上进行系列稀释法确认最终浓度8。
  4. 将玫瑰红B（RB）粉末溶于 1× PBS 中，配制 4% 的储备液。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，避光保存于 4 °C。RB 的最终工作浓度为 0.2%。
  5. 在 1.5 mL 微量离心管中，向 1 mL 对数期 C. albicans 培养物中加入 111 µL 的 2% RB 溶液，在室温下共孵育不同时间（0、15 和 30 分钟），以研究 RB 在细胞内的吸收情况（图 2）。
  6. 用 1 mL 1× PBS 将共孵育体系洗涤三次，每次在室温下以 16,100 × g 离心 2.5 分钟。
    注：aPDT 包含四种不同条件：绝对对照组（无光照、无 RB）、暗对照组（无光照但含 RB 孵育）、光对照组（有光照但无 RB）、aPDT 组（有光照且含 RB）。
  7. 将 C. albicans 重悬于 1 mL 1× PBS 中，每种条件分别分配至 96 孔板中的三个不同孔中。洗涤后将各孔与 LED 阵列对齐。
  8. 对于光照组，开启电风扇和光源。
    ​注：通过改变光照时间可实现不同的能量密度（J/cm2）。例如，使用 10 mW/cm2 的 LED 光源照射 16.7 分钟可达到 10 J/cm2 的能量密度。
  9. 照射后，从一个孔中取 20 µL 共孵育液加入含有 180 µL 1× PBS 的 1.5 mL 离心管中，制备 10 倍稀释液。随后按照相同方法继续进行 10 倍系列稀释。
  10. 将每种系列稀释液各取 20 µL 滴加三滴至 YPD 琼脂平板的一个象限，以获得可计数的菌落。通过将菌落数乘以稀释倍数计算 CFU/mL3。

4. 统计学分析

  1. 使用绘图和统计分析软件分析收集的数据（参见材料表）。
  2. 以均值 ± 均值标准误表示数据。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）8 评估不同测试条件之间的显著性差异。
  3. 进行Tukey多重比较检验以进行两两比较8。针对每种不同处理，至少独立重复实验三次。将p值<0.05视为具有统计学显著性。

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结果

图1展示了本研究中使用的aPDT系统。由于高温可能导致显著的细胞死亡，因此在照射过程中使用电风扇对LED阵列进行冷却，并使用散热片以维持温度恒定在25 ± 1 °C。由此可排除热效应的影响。均匀的光照分布也是成功实施aPDT的重要决定因素；因此，在照射期间必须精确地将LED灯泡与孔板孔位对齐。由于LED亮度较高，在开启光源前需佩戴太阳镜。

C. albicans 经RB染色后立即在荧光显微镜下观察到红色荧光（图2中0分钟）。可见RB以时间依赖性方式进入细胞（图2）。本研究采用15分钟的RB孵育时间，此时大多数细胞已被RB染色。较高的RB浓度可产生更强的荧光，从而生成更多自由基以杀灭真菌。然而，它也可能导致正常细胞显著死亡；因此，临床上通常使用0.2%的RB浓度。本研究即选用该确切浓度。

光动力疗法（PDT）涉及利用光照激活玫瑰红（RB）。当...

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讨论

近期已有关于玫瑰红光动力疗法（RB-PDT）在真菌性角膜炎临床应用中取得良好效果的报道19。玫瑰红（RB）的吸收峰位于450–650 nm。为确保aPDT成功实施，确定光源的辐照度至关重要。治疗癌细胞通常需要较高的能量密度（一般>100 J/cm2），而治疗感染性病灶则预期使用较低的能量密度6。高能量密度意味着较长的照射时间，在临床实践中可能不具可行性。在治疗真菌性角膜炎时，眼科领域普遍认可的能量密度为5.4 J/cm220。此外，玫瑰红过长的孵育时间也不利于患者接受aPDT治疗。因此，后续实验选择15分钟作为孵育时间。

某些步骤对于实验的成功至关重要。用于真菌培养的琼脂平板在开启风扇的层流罩中干燥15-20分钟，以减少表面水分。若表面潮湿，真菌液滴会流动并相互混合，从而阻止单菌落的形成。

所有实验均需在弱光条件下进行，以防止玫瑰红B...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了中国台湾教育部（MOE）高等教育深耕计划特色领域研究中心项目以及中国台湾科技部资助的国立成功大学应用奈米医学中心的资助 [MOST 109-2327-B-006-005]，资助对象为 TW Wong。J.H. Hung 感谢来自中国台湾国立成功大学医院 [NCKUH-11006018] 及 [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] 的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Neptune，美国加利福尼亚州圣迭戈#3745.x
带细胞筛网帽的5 mL圆底管Falcon，美国#352235
96孔板中国台湾桃园县Alpha plus#16196
铝箔中国台湾台南
铝制散热片Nanyi electronics Co., Ltd.，中国台湾台南BK-T220-0051-01散去LED阵列产生的热量。
离心德国艾本多夫公司，英国5415R
GraphPad Prism 软件GraphPad 8.0，美国加利福尼亚州圣地亚哥绘图与统计分析软件
绿色发光二极管（LED）灯带Nanyi electronics Co., Ltd.，台南，中国台湾2835发射峰波长：525 nm，视角：150°°；源自 https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
培养箱Yihder，中国台湾台北LM-570D (R)
光功率计Ophir，耶路撒冷，以色列PD300-3W-V1-传感器
Millex 0.22 μm 滤膜美国新泽西州默克公司SLGVR33RS
耐多药白色念珠菌生物资源收集与研究中心，中国台湾新竹BCRC 21538/ATCC 10231http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
光密度600 分光光度计Biochrom，英国伦敦Ultrospec 10
玫瑰红素Sigma-Aldrich，密苏里州，美国330000储存浓度 40 mg/mL = 4%，用 PBS 配制，4 ℃ 保存 °C
无菌玻璃管Sunmei Co., Ltd.，中国台湾台南AK45048-16100
酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基印度 HIMEDIAM1363

参考文献

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