הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיפול פוטודינמי בתיווך רוז בנגל לעיכוב קנדידה אלביקנס

3.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63558

⸱

24 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Department of Dermatology, Fu Jen Catholic University Hospital, Fu Jen Catholic University, 6Institute of Clinical Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7School of Medicine, National Cheng Kung University, 8Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 9Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

השכיחות הגוברת של קנדידה אלביקנס עמידים לתרופות היא בעיה בריאותית חמורה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע אסטרטגיה למאבק בזיהומים פטרייתיים עמידים לתרופות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את יעילות ה-aPDT בתיווך בנגל רוז על זן C. albicans עמיד בפני multidrug במבחנה.

תקציר

זיהום קנדידה אלביקנס פולשני הוא זיהום פטרייתי אופורטוניסטי משמעותי בבני אדם מכיוון שהוא אחד המתיישבים הנפוצים ביותר במעיים, בפה, בנרתיק ובעור. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, שיעור התמותה של קנדידה פולשנית נותר כ -50%. למרבה הצער, השכיחות של C. albicans עמידים לתרופות עולה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע טיפול חלופי או אדג'ובנטי כדי לעכב את היווצרות הביופילם של C. albicans ולהתגבר על עמידות לתרופות. APDT בתיווך רוז בנגל (RB) הראה הרג יעיל של תאים של חיידקים ושל C. albicans. במחקר זה מתוארת היעילות של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג. מקור אור ביתי של דיודה ירוקה פולטת אור ירוק (LED) מתוכנן להתיישר עם מרכזה של באר של צלחת בעלת 96 בארות. השמרים דוגרו בבארות עם ריכוזים שונים של RB והוארו בפלואנסים משתנים של אור ירוק. השפעות ההרג נותחו בשיטת דילול הצלחת. עם שילוב אופטימלי של אור ו- RB, הושגה עיכוב צמיחה של 3 לוגים. הוסק כי RB-aPDT עשוי לעכב C. albicans עמידים לתרופות.

מבוא

C. albicans מתיישבת במערכת העיכול ובמערכת העיכול והגניטורין של אנשים בריאים וניתן לזהות אותה כמיקרוביוטה רגילה בכ-50 אחוז מהאנשים1. אם נוצר חוסר איזון בין הפונדקאי לפתוגן, C. albicans מסוגל לפלוש ולגרום למחלות. הזיהום יכול לנוע בין זיהומים ריריים מקומיים בממברנה ועד לכשל איברים מרובים2. במחקר מעקב רב-מרכזי בארה"ב, כמחצית מהמבודדים מחולים עם קנדידה פולשנית בין 2009 ל-2017 הם C. albicans3. קנדידמיה יכולה להיות קשורה לשיעורי תחלואה גבוהים, תמותה, שהייה ממושכת בבית החולים4. המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב דיווחו כי כ-7% מכל דגימות הדם של קנדידה שנבדקו עמידות לתרופה האנטי-פטרייתית fluconazole5. הופעתם של מיני קנדידה עמידים לתרופות מעלה את החשש לפתח טיפול חלופי או אדג'ובנטי לחומרים אנטי-מיקוטיים.

טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) כולל הפעלת פוטוס-סנסיטיזר ספציפי (PS) עם אור באורך הגל של שיא הקליטה של ה-PS6. לאחר העירור, PS הנרגש מעביר את האנרגיה או האלקטרונים שלו למולקולות החמצן הסמוכות וחוזר למצב הקרקע. במהלך תהליך זה נוצרים מיני חמצן תגובתי וחמצן סינגלט וגורמים נזק לתאים. aPDT נמצא בשימוש נרחב כדי להרוג מיקרואורגניזמים מאז שנות ה-90של המאה ה-20. אחד היתרונות של aPDT הוא שמספר אברונים ניזוקים בתא על ידי חמצן יחיד ו/או מיני חמצן תגובתי (ROS) במהלך הקרנה; לפיכך, ההתנגדות ל-aPDT לא נמצאה עד היום. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי החיידקים ששרדו לאחר aPDT נעשו רגישים יותר לאנטיביוטיקה8.

מקורות האור המשמשים ב-aPDT כוללים לייזרים, מנורות הלוגן מתכתיות עם מסננים, אור אינפרה-אדום קרוב ודיודה פולטת אור (LED)9,10,11,12. הלייזר מספק עוצמת אור גבוהה, בדרך כלל גדולה מ-0.5 W/cm2, המאפשרת אספקה של מינון אור גבוה בזמן קצר מאוד. זה כבר בשימוש נרחב במקרים שבהם זמן טיפול ארוך יותר אינו נוח כגון aPDT עבור זיהומים דרך הפה. החיסרון של לייזר הוא שגודל התאורה הנקודתי שלו קטן, ונע בין כמה מאות מיקרומטרים ל -10 מ"מ עם מפזר. יתר על כן, ציוד לייזר הוא יקר וזקוק להכשרה ספציפית כדי לפעול. מצד שני, שטח ההקרנה של מנורת הלוגן מתכתית עם פילטרים גדול יחסית13. עם זאת, המנורה חסונה ויקרה מדי. מקורות אור LED הפכו למיינסטרים של aPDT בתחום הדרמטולוגי מכיוון שהוא קטן וזול יותר. שטח ההקרנה יכול להיות גדול יחסית עם סידור מערך של נורת ה-LED. ניתן להאיר את כל הפנים בו זמנית9. עם זאת, רוב, אם לא כל, מקורות תאורת ה-LED הזמינים כיום מיועדים לשימוש קליני. זה לא יכול להיות מתאים לניסויים במעבדה כי זה תופס מקום ויקר. פיתחנו מערך LED זול שהוא קטן מאוד וניתן לחתוך ולהרכיב אותו מרצועת LED. ניתן להתאים את נוריות ה- LED לסידורים שונים עבור עיצובים ניסיוניים שונים. ניתן להשלים תנאים שונים של aPDT בצלחת של 96 בארות או אפילו בצלחת של 384 בארות בניסוי אחד.

ורד בנגל (RB) הוא צבע צבעוני הנמצא בשימוש נרחב להגברת ההדמיה של נזקי הקרנית בעיני אדם14. aPDT בתיווך RB הראה השפעות הרג על סטפילוקוקוס אאורוס, Escherichia coli ו- C. albicans עם יעילות דומה פחות או יותר לזו של טולואידין כחול O15. מחקר זה מדגים שיטה לאימות ההשפעה של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מערכת aPDT

  1. חותכים ארבע דיודות פולטות אור ירוק (נוריות LED) מרצועת LED (ראו טבלת חומרים) ומיישרים אותן עם ארבע בארות של לוחית בעלת 96 בארות (איור 1).
    הערה: נוריות ה-LED סודרו במערך של 4 x 3. החלק האחורי של הנורית הודבק לגוף קירור כדי לפזר חום במהלך ההקרנה.
  2. מדוד את קצב הפלואנס11 של הנורית ב- 540 ננומטר באמצעות מד הספק אור (ראה טבלת חומרים). ראו איור משלים 1 כדי להבטיח שקצב הפלואנס של ה-LED יהיה בין 510-560 ננומטר.
  3. הניחו מאוורר חשמלי לצד הצלחת במהלך ההקרנה כדי לשמור על הטמפרטורה הקבועה (25 ± 1 מעלות צלזיוס) 11. ראו איור משלים 2 כדי להבטיח שהטמפרטורה הקבועה של התווך תישמר במהלך ההקרנה.

2. התרבות של צורת השמרים של C. albicans

הערה: C. albicans עמידים למולטי-דרוג (BCRC 21538/ATCC 10231), עמיד בפני רוב החומרים האנטי-פטרייתיים, כולל פלוקונאזול, משמש לניסויים16.

  1. קבע את הרגישות לתרופות אנטי-מיקוטיות באמצעות שיטת דיפוזיה של דיסקים בעקבות דו"ח17 שפורסם בעבר.
  2. לגדל C. albicans בצורות שמרים, hyphae, ו pseudohyphae בהתאם לסביבות המיקרו-אקולוגיות18.
    הערה: הצורות hyphae ו- pseudohyphae קשות לחישוב מדויק. ניתן לחשב את צורת השמרים במדויק תחת מיקרוסקופ או עם ציטומטריה של זרימה. הטמפרטורה במהלך צמיחת התא קובעת את המורפולוגיה שלו. בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס), כמעט כל התאים הם בצורת שמרים. דגירה קצרה של 4 שעות של C. albicans בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לא השפיעה על מורפולוגיית השמרים שלה.

3. aPDT על פלנקטוני C. albicans

  1. מבודדים מושבה אחת של C. albicans מצלחת אגר עם לולאה סטרילית ומוסיפים אותה למדיום של תמצית שמרים של 3 מ"ל פפטון דקסטרוז (YPD) (ראו טבלת חומרים) בצינור זכוכית מעוקר.
    1. דגירה של הצינור ב-25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך הלילה (14-16 שעות) באינקובטור עם מהירות סיבוב של 155 סל"ד כדי להרחיב את C. albicans ולשמור על הפטרייה בצורת שמרים לכימות מדויק.
  2. דיללו את תרבית הלילה עם ערך בינוני עדOD 600 של כ-0.5 ב-30 מעלות צלזיוס וסובבו במהירות של 155 סל"ד למשך 4 שעות כדי להשיג שלב צמיחה של לוג של C. albicans.
  3. דיללו שוב את תרבות שלב היומן עם מדיום YPD טרי לערך OD600 של 0.65 (בערך 1 x 107 יחידות יוצרות מושבה, CFU/mL). אשרו את הריכוז הסופי בשיטת דילול סדרתי על צלחת אגר8.
  4. הכינו תמיסת מלאי (4%) של רוז בנגל (RB) על ידי המסת האבקה ב-1x PBS. מסננים ומעקרים אותו עם מסנן של 0.22 מיקרומטר ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. ריכוז העבודה הסופי של RB הוא 0.2%.
  5. הוסיפו 111 μL של 2% RB ל-1 מ"ל של אלביקנים מסוג C. פאזה לוגית בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ובתרבית משותפת בנקודות זמן שונות (0, 15 ו-30 דקות) בטמפרטורת החדר כדי להבין את ספיגת ה-RB בתאים (איור 2).
  6. שטפו את התרבות המשותפת שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS עם צנטריפוגה ב-16,100 x גרם למשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: aPDT מכיל ארבעה תנאים שונים: שליטה מוחלטת (ללא חשיפה לאור, ללא RB), שליטה בחושך (ללא אור אלא דגירה עם RB), בקרת אור (חושף לאור ללא RB), aPDT (חושף לאור בנוכחות RB).
  7. בצעו החייאה של ה-C. albicans ב-1 מ"ל של 1x PBS והקצו אותם לשלוש בארות שונות בלוחית קידוח של 96 עבור כל מצב. יישרו את הבארות עם מערך ה-LED לאחר הכביסה.
  8. בקבוצות חשופות אור, הפעילו את המאוורר החשמלי ואת האור.
    הערה: ניתן להשיג פלואנס שונה (J/cm2) על ידי חשיפת הבארות לתקופות זמן משתנות. לדוגמה, חשיפת אור של 16.7 דקות מגיעה ל-10 J/cm2 עם נורת LED של 10 mW/cm2 .
  9. לאחר הקרנה, הוסף 20 μL של תמיסת התרבית המשותפת מבאר אחת לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 180 μL של 1x PBS כדי להכין דילול של פי 10. יתר על כן, לדלל עשר פעמים, ולאחר מכן בעקבות אותה שיטה.
  10. שחררו שלוש טיפות של 20 μL מכל דילול סדרתי על רבע אחד של צלחת אגר YPD כדי להשיג מושבות הניתנות לספירה של הצלחת. חשב את ה-CFU/mL על ידי הכפלת המושבות בגורמי הדילול3.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. נתחו את הנתונים שנאספו באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה (ראו טבלת חומרים).
  2. תאר נתונים לפי ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. בצע ניתוח ANOVA דו-כיווני של שונות8 כדי להעריך הבדלים משמעותיים בין תנאי הבדיקה השונים.
  3. בצע את מבחני ההשוואה המרובים של Tukey עבור השוואות זוגיות8. עבור כל טיפול שונה, בצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. שקול ערך p < 0.05 מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מראה את מערכת ה-aPDT שבה נעשה שימוש במחקר הנוכחי. מכיוון שטמפרטורות גבוהות עלולות לגרום למוות תאי משמעותי, מערך ה-LED מקורר על ידי מאוורר חשמלי, וגוף קירור משמש במהלך הקרנה כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 25 ± 1 °C (74 °F). ניתן לזלזל באפקט החום. התפלגות אור אחידה היא גם גורם מכריע חשוב עבור aPDT מוצלח; לכן, חשוב ליישר את נורת ה-LED לבאר בדיוק במהלך התאורה. בשל הבהירות של הנורית, משקפי שמש צריכים להיות מצוידים לפני הדלקת האור.

C. albicans מוכתם מיד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תוצאות מעודדות של יישומים קליניים של RB-PDT עבור קרטיטיס פטרייתית דווחו לאחרונה19. שיא הספיגה של RB הוא ב 450-650 ננומטר. חיוני לקבוע את קצב הפלואנס של מקור האור עבור aPDT מוצלח. פלואנס גבוה (בדרך כלל >100 J/cm2) נדרש לטיפול בתאים סרטניים, בעוד פלואנס נמוך יותר צפוי לטפל בנגעים נגועים6. פלואנס גבוה פירושו זמן חשיפה ארוך אשר עשוי להיות לא מעשי במסגרת קלינית. לטיפול בקרטיטיס מיקוטית, מוסכם על 5.4 J/cm2 בקהילה האופתלמולוגית20. זמן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו קיבלה מימון מהמרכז לננו-רפואה יישומית, אוניברסיטת צ'נג קונג הלאומית מתוכנית מרכז המחקר לאזורים נבחרים במסגרת פרויקט הנבטים להשכלה גבוהה על ידי משרד החינוך (MOE), ומשרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן [MOST 109-2327-B-006-005] ל- TW וונג. J.H. Hung מכיר במימון מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי צ'נג קונג, טייוואן [NCKUH-11006018], ו[MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרופוגה 1.5 מ"לנפטון, סן דייגו, ארה"ב# 3745.x
5 מ"ל צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאיםפלקון, ארה"ב# 352235
צלחת 96 בארותאלפא פלוס, טאויואן סיין, טייוואן# 16196
רדיד אלומיניוםsunmei, טיינאן, טייוואן
גוף קירור אלומיניוםNanyi electronics Co., Ltd., טיינאן, טייוואןBK-T220-0051-01מפזר חום ממערך ה-LED.
צנטריפוגהאפנדורף, בריטניה5415R
תוכנת פריזמה של לוח גרףGraphPad 8.0, סן דייגו, קליפורניה, ארה"בתוכנת גרפים וסטטיסטיקה
דיודה פולטת אור ירוק (LED) רצועתNanyi electronics Co., Ltd., טיינאן, טייוואן2835אורך גל שיא פליטה: 525 ננומטר, זווית צפייה: 150°; מקורו
בחממת https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63Yihder, טאיפיי, טייוואןLM-570D (R)
מד כוח אוראופיר, ירושלים, ישראלPD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μ m filterMerck, ניו ג'רזי, ארה"בSLGVR33RS
ביולוגי של משאבים ביולוגיים עמידים לתרופות מרובותתרופות, שינג'ו, טייוואןBCRC 21538/ATCC 10231http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 ספקטרופוטומטרBiochrom, לונדון, בריטניהUltrospec 10
Rose BengalSigma-Aldrich, MO, ארה"ב330000ריכוז מלאי 40 מ"ג/מ"ל = 4%, מכינים ב-PBS, מאוחסן ב-4 מעלות;
C צינור זכוכית מעוקרSunmei Co., Ltd., טיינאן, טייוואןAK45048-16100
תמצית שמרים פפטון דקסטרוז בינוניHIMEDIA, הודוM1363
רצועת מרכז איסוף ומחקר

מקורות

  1. Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
  2. Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
  3. Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
  4. Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
  5. Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia - four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
  6. Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195(2020).
  7. Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
  8. Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411(2019).
  9. Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
  10. Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
  11. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  12. Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595(2021).
  13. Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
  14. Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
  15. Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
  16. Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440(2021).
  17. Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
  18. Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629(2017).
  19. Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011(2021).
  20. Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טיפול פוטודינמי אנטימיקרוביאליקנדידה עמידה לתרופותעיכוב ביופילםהקרנת LED ירוקהדילול סדרתימיקרוסקופיה פלואורסצנטיתחמצן סינגלט
טיפול פוטודינמי בתיווך רוז בנגל לעיכוב קנדידה אלביקנס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.