Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا يصف ثقافة المواد العضوية المعوية للكلاب في نظام دعم مزدوج الحجرة وقابل للنفاذ. يتم وصف البذر العضوي في الدعامات القابلة للنفاذ ، وصيانة الطبقة الأحادية ، وتجارب نفاذية الدواء اللاحقة.
Abstract
يستخدم نظام الدعم القابل للنفاذ عادة بالاقتران مع خطوط الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) كأداة في المختبر لتقييم النفاذية الفموية للأدوية العلاجية المرشحة الجديدة. ومع ذلك ، فإن استخدام خطوط الخلايا التقليدية هذه له قيود ، مثل التعبير المتغير عن التقاطعات الضيقة ، والتمايز الجزئي للخلايا ، وغياب المستقبلات النووية الرئيسية. على الرغم من أوجه القصور هذه ، فإن نماذج Caco-2 و MDCK مقبولة على نطاق واسع ويتم التحقق من صحتها للتنبؤ بالنفاذية الفموية البشرية في الجسم الحي .
الكلاب هي نموذج انتقالي ذي صلة للبحوث الطبية الحيوية بسبب أوجه التشابه بينها في تشريح الجهاز الهضمي والبكتيريا المعوية مع البشر. وبناء على ذلك، ودعما لتطوير الأدوية الموازية، فإن وضع أداة فعالة ودقيقة في المختبر للتنبؤ بخصائص نفاذية الدواء في الجسم الحي سواء في الكلاب أو البشر أمر مرغوب فيه للغاية. يمكن أن تكون هذه الأداة هي النظام العضوي المعوي للكلاب ، الذي يتميز بهياكل ظهارية ثلاثية الأبعاد (3D) ، مجمعة ذاتيا مشتقة من الخلايا الجذعية البالغة.
يصف بروتوكول بذر الدعم المنفذ (1) الطرق التجريبية لفصل وبذر عضويات الكلاب في الإدراجات. تم وصف عزل الكلاب العضوية وثقافتها وحصادها سابقا في مجموعة منفصلة من البروتوكولات في هذا العدد الخاص. تتم مناقشة طرق الصيانة العامة للطبقة الأحادية العضوية المعوية للكلاب بدقة في بروتوكول الصيانة (2) أحادي الطبقة. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طرق تقييم السلامة الهيكلية للطبقة الأحادية عبر قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) والمجهر الضوئي. وأخيرا، يصف البروتوكول التجريبي (3) للنفاذية المهام التي تسبق التجربة مباشرة، بما في ذلك التحقق من صحة النتائج التجريبية في المختبر .
بشكل عام ، يتغلب نموذج الكلاب العضوي ، جنبا إلى جنب مع تقنية زراعة الخلايا ثنائية الغرفة ، على القيود المرتبطة بالنماذج التجريبية 2D ، وبالتالي تحسين موثوقية التنبؤات بالنفاذية الفموية الواضحة للأدوية العلاجية المرشحة لكل من الكلاب والمريض البشري.
Introduction
تستخدم أنظمة الدعم القابلة للنفاذ عادة لتحديد النفاذية الواضحة للأدوية العلاجية المرشحة من خلال الحاجز الظهاري المعوي 1,2. ويمكن أيضا استخدامها لتقييم الإفراز الخلوي3 ، وهجرة الخلايا4 ، وسمية المخدرات5. تعد فحوصات نفاذية الدواء عن طريق الفم في المختبر خطوة رئيسية في عملية اكتشاف الأدوية وتطويرها2 ، حيث يتم اختبار الأدوية المرشحة الفردية في المرحلة المبكرة من دورة حياة البحث والتطوير للدواء6. نظام الدعم النافذ هو جهاز زراعة خلايا ثنائي الغرفة يتكون من إدراج مع غشاء شبه مسامي يوضع في صفيحة متعددة الآبار. يسمح هذا النظام بالوصول المباشر إلى الجوانب القمية والقاعدية للخلية أحادية الطبقة المزروعة في الإدراج7. عادة ما يتم اشتقاق الطبقة الأحادية المستخدمة في هذه الأنظمة من الخلايا الظهارية المعدية المعوية (على سبيل المثال ، خط الخلايا الغدية لسرطان القولون والمستقيم البشري Caco-2)8. تنمو مزارع الخلايا في حالة استقطاب تحاكي البنية الدقيقة الطبيعية للخلايا الظهارية المعوية ، مما يتيح المزيد من التمايز الخلوي ، والتشريح الدقيق المماثل والوظيفة7. يمكن العثور على تفاصيل إدراج الدعم القابل للنفاذ في الشكل 1. إن بذر الإدخالات ذات مزارع الخلايا 2D ، التي تستخدم تقليديا لتقييم نفاذية الدواء المعوي ، ميسور التكلفة نسبيا وسهل الاستزراع9. تقدم هذه الأنظمة العديد من القيود الرئيسية ، بما في ذلك قدرتها المحدودة على التنبؤ بالتمثيل الغذائي المعوي للأدوية العلاجية المرشحة10,11. وينطبق هذا على جميع آليات امتصاص الأدوية، سواء كان ذلك الامتصاص السلبي من خلال التقاطعات الضيقة بين الخلايا الظهارية، أو الامتصاص النشط عبر الظهارة من خلال التدفق السائل، أو ناقلات الامتصاص (على سبيل المثال، البروتين السكري P، ناقل أحادي الكربوكسيلات 1)، والأدوية التي يتم استقلابها بواسطة الخلايا المعوية.
تشترك الكلاب في بيئة مشتركة ونظام غذائي مشترك مع البشر12. يشبه تشريح الكلاب المعوية وتكوين الميكروبيوم إلى حد كبير تشريح البشر13 ، والذي يعزى إلى التدجين والوجبات الغذائية المشتركة على مدى السنوات ال 36000 الماضية14. لسوء الحظ ، يمكن أن تكون أوجه التشابه هذه أيضا أسبابا / محفزات شائعة لتطوير المرض. تصاب الكلاب بأمراض مزمنة مماثلة للبشر ، مثل السمنة 15 ، ومرض التهاب الأمعاء 16 ، وسرطان القولون والمستقيم الغدي 17 ، والورم اللحمي المعدي المعوي (GIST) 18 ، والعديد من الأمراض الأخرى المرتبطة بطول عمرها النسبي 19. وبناء على ذلك، يمكن استخدام عضويات الكلاب بنجاح في إجراء بحوث انتقالية عكسية لهذه الأمراض المزمنة المتعددة العوامل بروح مبادرة الصحة الواحدة20.
خلايا Caco-2 هي خطوط الخلايا الأكثر استخداما لمقايسات امتصاص الدواء عن طريق الفم21. تعتبر هذه الخلايا حاليا نموذج "المعيار الذهبي" لاختبارات نفاذية الأمعاء في المختبر 2،22،23. يعبر خط خلايا Caco-2 عن ناقلات التدفق والامتصاص الموجودة في الأمعاء البشرية ، على الرغم من اختلاف مستويات التعبير24،25،26. تستخدم خلايا Caco-2 أيضا على نطاق واسع كنماذج لتحديد ما إذا كان الدواء ركيزة أو مثبطا لناقلات التدفق المعوي22,27. على الرغم من أن خلايا Caco-2 هي من أصل القولون ، إلا أنها تحاكي خلية الخلايا المعوية. لسوء الحظ ، لا تمثل خلايا Caco-2 سوى نوع خلية واحد من الطبقة الظهارية للأمعاء الدقيقة9 ، والتي تفشل في تلخيص تكوين نوع الخلايا الظهارية المعوية المعقدة بدقة. على سبيل المثال ، تغيب الخلايا الكأسية المخصصة لإنتاج المخاط عن مزارع Caco-2 بحيث لا يمكن تقييم التفاعلات المخاطية الدوائية دون الزراعة المشتركة مع خطوط الخلايا الأخرى28. علاوة على ذلك ، لا تعبر ثقافات Caco-2 عن العديد من المستقبلات النووية المهمة الموجودة عادة في الأمعاء ، مثل مستقبلات pregnane X (PXR) ، ومستقبلات الستيرويد X (SXR) ، ومستقبلات androstane التأسيسية (CAR)29. ونتيجة لذلك، تفشل ثقافات الكاكو-2 في نمذجة تحريض ناقلات الأدوية والإنزيمات بواسطة بعض الأدوية التي تحفز هذه المستقبلات (مثل ريفامبين)30.
تعالج تقنية العضوية المعوية 3D بعض هذه القيود19. المواد العضوية هي تركيبات ذاتية التجميع مشتقة من الخلايا الجذعية البالغة التي يمكن إنشاؤها من عينات الأنسجة التي يتم حصادها باستخدام تقنيات microinvasive20. يتم استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان لنماذج نفاذية الأمعاء31,32. توفر عضويات الكلاب بديلا ذا صلة بالمواد العضوية البشرية لأن أبحاث الخلايا الجذعية البشرية مقيدة بالقضايا الأخلاقية33. علاوة على ذلك ، توفر الكلاب العضوية نظاما في المختبر لاستكشاف نفاذية أدوية الكلاب ، والتمثيل الغذائي ، والنقل النشط ، والتفاعلات بين الأدوية والعقاقير. لمعالجة هذه الفجوة التكنولوجية ، تم وصف النمو المتسق والموثوق به للعضويات المعوية للكلاب في نظام دعم قابل للنفاذ34. قد يتنبأ فحص النفاذية مع المواد العضوية المعوية للكلاب بنفاذية الأمعاء للكلاب والتمثيل الغذائي لجزيئات الأدوية الصغيرة مقارنة بالمقايسات المستخدمة حاليا (Caco-2). إن تأكيد هذه الميزات المحورية يضفي هذا النظام الجديد في المختبر على العمل المستقبلي لاستكشاف التأثير المحتمل للمحفزات على التمثيل الغذائي داخل الخلايا والنقل النشط.
تتكون عضويات الكلاب من جميع أنواع الخلايا الموجودة عادة في الطبقة الظهارية للأمعاء. من وجهة نظر وظيفية وتشريحية دقيقة ، فإنها تكرر بشكل موثوق بيئة الطبقة الظهارية لأمعاء الكلاب19,35. علاوة على ذلك ، فإن وجود المخاط ، وناقلات الأدوية والإنزيمات الخاصة بالكلاب ، والتمايز الخلوي العام في الأعضاء المعوية للكلاب يمكن مقارنته بما شوهد في الجسم الحي في الكلاب34. وبالتالي ، يمكن عزل المواد العضوية من المرضى البيطريين المرضى واستخدامها لنمذجة تأثير عمليات المرض المختلفة (على سبيل المثال ، التهاب الأمعاء المزمن) على نفاذية الدواء عن طريق الفم الكلاب19,36. يمكن أيضا استخدام نظام العضوية المعوية للكلاب في إعدادات أخرى غير تجارب نفاذية الدواء. يمكن أيضا عزل هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد عن المرضى المرضى كما وصفها سابقا تشاندرا وآخرون لمرض التهاب الأمعاء ، وسرطان القولون والمستقيم الغدي ، والورم اللحمي المعدي المعوي19.
يصف بروتوكول بذر الدعم المنفذ طرقا لإنشاء مزارع عضوية معوية للكلاب في الإدراجات. يحدد هذا البروتوكول الأول طرقا لفصل ثقافات الكلاب العضوية القائمة المطلية في مصفوفة الغشاء خارج الخلية. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة الطلاء المسبق للإدخالات بالكولاجين I ومصفوفة الغشاء خارج الخلية في هذا البروتوكول. كما يتم وصف تضمين عضويات الكلاب في إدراج الدعم القابل للنفاذ بالتفصيل.
البروتوكول الثاني هو بروتوكول صيانة الطبقة الأحادية ، والذي يتضمن الصيانة العامة للكلاب العضوية 3D المطلية في إدراج. يتم عرض تواتر وأحجام الوسائط العضوية المستخدمة لتحديث الثقافة ، وطرق منع تلف زراعة الخلايا ، في هذا البروتوكول الثاني ، إلى جانب الطرق التجريبية لتقييم التقاء الطبقة الأحادية الظهارية.
أخيرا ، يركز البروتوكول التجريبي للنفاذية على طرق لتحديد ما إذا كانت عضويات 3D المعوية للكلاب في فحص النفاذية جاهزة للاستخدام التجريبي وخطوات التحقق اللازمة قبل إجراء أي تجربة. يصف هذا القسم أيضا الإعداد والتنفيذ الناجح لتجربة النفاذية ، إلى جانب حضانة وأخذ عينات من الأدوية العلاجية المرشحة في غرف ثقافة الطبقة الأحادية. ويناقش أيضا استخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسين منخفضة النفاذية (FITC-dextran) لمراقبة سلامة الطبقة الأحادية. أخيرا ، يتم وصف طريقة تقييم في المختبر للتحقق من صحة النتائج بعد الانتهاء من التجربة. تجارب النفاذية هي موضوع واسع للغاية ويتم تلخيصها بشكل جيد للغاية من قبل Hubatsch et al.37. ويرد في الشكل 2 موجز لسير عمل البروتوكولات.
الشكل 1: عضويات الكلاب المعوية على نظام دعم قابل للنفاذ. يتم وضع ملحق الدعم القابل للنفاذ في بئر من لوحة 24 بئرا. يسمح الغشاء المسامي الدقيق ببذر المواد العضوية المعوية للكلاب المنفصلة ، وستشكل هذه الخلايا في النهاية طبقة أحادية العضوية 2D. تسمح هذه التقنية بالوصول إلى جانبي AP و BL من الطبقة الأحادية. يتم إدخال الوسط العضوي في كل من غرف AP و BL للدعم القابل للنفاذ. يتم توضيح امتصاص (AP→BL) وإفراز (BL→AP) للدواء المرشح ، بالإضافة إلى طريقتين محتملتين لنقل المخدرات. الاختصارات: AP = قمي; BL = القاعدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير عمل بروتوكولات الدعم العضوية النفاذة للكلاب. يتم طلاء إدراج الدعم القابل للنفاذ مسبقا بمزيج من مصفوفة الغشاء خارج الخلية والكولاجين I ويتم تحضينه لمدة 1 ساعة. أثناء عملية الحضانة ، يتم فصل الثقافة العضوية. يتم زرع الخلايا العضوية الفردية في الإدراج ، ويضاف الوسط في الغرفة القاعدية الجانبية مباشرة بعد البذر ، بينما يضاف الوسط إلى الغرفة القمية بعد 24 ساعة من انتهاء عملية البذر. تشمل صيانة ومراقبة المواد العضوية تغييرات متوسطة منتظمة ، وقياسات قيمة TEER ، والفحص المجهري الضوئي لتقييم سلامة الطبقة الأحادية. قبل التجربة ، يجب تمييز المواد العضوية عن طريق إزالة مثبطات ROCK و GSKiβ من الوسائط. يتم قياس قيم TEER في يوم التجربة ، ويتم فحص الطبقة الأحادية العضوية عبر المجهر الضوئي بحثا عن تلف الخلايا. ثم يتم استبدال الوسط بمخزن مؤقت مناسب واحتضانه قبل التجربة. يتم استخدام فحص FITC-dextran أثناء تجارب نفاذية الأمعاء39 كعلامة على سلامة الطبقة الأحادية. يتم أخذ قياسات TEER بعد التجربة ، وسيقوم الفحص المجهري الضوئي بالتحقق من صحة النتائج بعد 24 ساعة. الاختصارات: TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. ROCK = كيناز مرتبط ب rho; GSKiβ = الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا; F = التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
تمت الموافقة على البحث وتنفيذه وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها بجامعة ولاية أيوا (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). يصف القسم التالي (الخطوات 1.1-1.3) بروتوكول بذر الدعم القابل للنفاذ، ويتم تلخيص الإجراءات في الشكل 3.
الشكل 3: سير عمل بروتوكول بذر الدعم القابل للنفاذ. يتم طلاء إدخالات الدعم القابلة للنفاذ مسبقا بمزيج من CMGF + R / G والكولاجين I ومصفوفة الغشاء خارج الخلية ويتم احتضانها لاحقا. يتم شفط الوسائط من ثقافة الكلاب العضوية واستبدالها بمحلول استعادة الخلايا ، يليه حضانة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يتم نقل الثقافة لاحقا إلى أنبوب ، ويتم إجراء التفكك العضوي باستخدام البروتياز الشبيه بالتريبسين. تتم إزالة المواد العضوية غير المنفصلة عن طريق المرور عبر مصفاة لتحقيق تعليق أحادي الخلية ، ويتم تحديد تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي. يتم زرع الخلايا على إدراج دعم قابل للنفاذ ، ويضاف CMGF + R / G إلى الغرفة القاعدية. ثم يتم احتضان الثقافة لمدة 24 ساعة ، ويتم إزالة السائل المتبقي من الغرفة القمية واستبداله ب CMGF + R / G. الاختصارات: ROCK = كيناز مرتبط ب rho. GSKiβ = الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا; CMGF + R / G = وسط كامل مع عوامل نمو معززة بمثبط ROCK و GSKiβ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. بروتوكول البذر دعم نفاذية
- الطلاء المسبق لإدخالات الدعم القابلة للنفاذ
- تحضير وسط كامل مع عوامل النمو المعززة بمثبط كيناز البروتين المرتبط ب Rho (ROCK) ومثبط الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا (GSKiβ) (CMGF + R / G) وفقا للمعلومات الواردة في الجدول 1.
- قم بإعداد دلو ثلج وابدأ في إذابة مصفوفة الغشاء خارج الخلية على الجليد. ضع صفيحة من 24 بئرا تحتوي على العدد المطلوب من الإدخالات في الحاضنة لتسخينها. جمع الكولاجين ذيل الفئران I (3 ملغ / مل) ووضعه على الجليد مع الحماية من الضوء. جمع CMGF + R / G ووضعها على الجليد.
- احسب العدد الإجمالي للإدخالات والفراغات المطلوبة للتجربة، مع مراعاة 100 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل إدراج.
ملاحظة: إعداد المزيد من محلول الطلاء أكثر من الحاجة. يوصى بإعداد ما لا يقل عن 15٪ أكثر من اللازم. - في أنبوب 15 مل ، امزج CMGF + R / G مع مصفوفة الغشاء خارج الخلية (1٪) والكولاجين I (1٪) وامزج الماصة بلطف.
- قم بتغطية كل إدراج من البوليستر ب 100 ميكرولتر من محلول الطلاء ووضع الإدخالات في الحاضنة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ من الغلاف الجوي CO2 ) لمدة 1 ساعة.
- بعد الحضانة ، قم بشفط محلول الطلاء بعناية من كل إدراج باستخدام شفاط فراغ أو ماصة P1000 ، مع الحرص على عدم إزعاج مرشح الإدراج. ضع صفيحة مغلفة مسبقا في الحاضنة للتدفئة.
- تفكك الكلاب العضوي
ملاحظة: استخدم الكلاب العضوية التي تم استزراعها لمدة أربعة أيام على الأقل. قبل البدء في الانفصال ، ارجع إلى Gabriel et al.38 لتحديد متى تكون العينة صحية وكثيفة وكافية للتجريب. يوصى بفصل بئر إضافي واحد من المواد العضوية لكل إجراء لطلاء البئر. علاوة على ذلك ، يوصى بزيادة العدد المطلوب من الإدخالات بنسبة ~ 20٪ لحساب النمو العضوي غير المتكافئ أو الضرر الناجم عن التلاعب غير السليم. إذا كنت تخطط لاستخدام FITC-dextran ، فقم بإعداد آبار إضافية.- قم بإعداد دلو ثلج وقارورة من مخزون DMEM/F12 المتقدم 1x البارد في خزانة السلامة الأحيائية.
- ضع مصفوفة الغشاء خارج الخلية على الجليد لبدء الذوبان ، وغمرها في الجليد للحماية من الذوبان السريع وتجنب التصلب. ضع صندوقا من أطراف الماصة (P200) في الفريزر لطلاء مصفوفة الغشاء خارج الخلية.
- قم بتبريد جهاز طرد مركزي مبرد إلى 4 درجات مئوية.
- انقل CMGF+ R/G من الفريزر/الثلاجة إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. تجنب التعرض المباشر للضوء عندما يكون ذلك ممكنا.
- قم بإزالة جميع الوسائط من لوحة 24 بئرا مع زراعة العضوية لعدد مناسب من الآبار (بئر واحد من صفيحة 24 بئرا لكل 2-4 إدراجات) مع الحرص على عدم إزعاج مصفوفة الغشاء خارج الخلية.
ملاحظة: قد يختلف مستوى الصوت وفقا لنظام عد الخلايا المستخدم. - أضف 0.5 مل من محلول استعادة الخلايا المبرد مسبقا لكل بئر لإذابة قباب مصفوفة الغشاء خارج الخلية.
- احتضن الطبق في الثلاجة (4 درجات مئوية) لمدة 30 دقيقة.
- ماصة التعليق ، وجمع جميع المواد العضوية ومصفوفة الغشاء خارج الخلية الذائبة ، ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
- جهاز طرد مركزي (700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) وإزالة supernatant حتى يصل المستوى إلى علامة 0.5 مل ، مع التأكد من عدم إزعاج الكرية.
- أضف 1 مل من البروتياز الشبيه بالتريبسين واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. نفض الأنبوب عدة مرات خلال فترة الحضانة لخلط الخلايا.
- انقل الأنبوب مع العينة مرة أخرى إلى خزانة السلامة الأحيائية وأضف ببطء 7 مل من DMEM / F12 المتقدم المبرد مسبقا لتعطيل البروتياز الشبيه بالتريبسين وإيقاف تفكك الخلايا.
- قبل تبلل مصفاة خلية 40 ميكرومتر مع 1 مل من DMEM / F12 المتقدم. ماصة بلطف الخليط وتصفية التعليق من خلال ؛ ماصة إضافية متقدمة DMEM/F12 لشطف المصفاة.
- جهاز الطرد المركزي للأنبوب (700 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) وإزالة supernatant. لا تزعج الكريات.
- أعد تعليق بيليه الخلية في ~ 50-100 ميكرولتر من وسط الاستزراع (CMGF + R / G) لكل بئر من المواد العضوية التي تم فصلها.
- عد عينة فرعية من التعليق (~ 10 ميكرولتر) باستخدام مقياس دمية أو جهاز مناسب وحدد إجمالي عدد الخلايا في التعليق.
- الكلاب العضوية البذر
- قم بتخفيف أو تركيز تعليق الخلية للحصول على تركيز خلية يبلغ ~ 75000 خلية لكل مل.
- بذور 100 ميكرولتر من التعليق في كل إدراج باستخدام نصائح BSA (1٪) المطلية مسبقا لتجنب التصاق الخلايا أثناء النقل. أضف إدراجا واحدا مغلفا كفراغ خال من الخلايا دون نمو أي عضويات مع الاستمرار في تلقي تغييرات الوسائط العادية.
- قم بتدوير اللوحة بلطف في حركة دائرية لمدة ~ 30 ثانية لتفريق الخلايا البذرية عبر الإدراج. تأكد من خلال الفحص المجهري الضوئي التوزيع المتساوي للخلايا.
- أضف 700 ميكرولتر من CMGF + R / G إلى الغرفة القاعدية الجانبية وضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ CO2 الغلاف الجوي) لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة ، قم بإزالة تعليق الخلية برفق من الغرفة القمية واستبدله ب 200 ميكرولتر من CMGF + R / G. أعد اللوحة إلى الحاضنة.
2. بروتوكول صيانة أحادي الطبقة للخلايا العضوية
ملاحظة: يصف المقطع التالي (الخطوات 2.1-2.2) بروتوكول صيانة أحادي الطبقة للخلية العضوية. ويرد في الشكل 4 موجز لسير عمل الإجراءات المعروضة في هذا البروتوكول. ويرد في الجدول التكميلي 1 جدول لتدوين الملاحظات التي يمكن أن تساعد في توحيد قياسات قيمة TEER.
الشكل 4: سير عمل صيانة ثقافة الدعم القابلة للنفاذ. يتم قياس قيم TEER باستخدام الأقطاب الكهربائية (المجسات) ومقياس فولت / أوم. يجب تعقيم المجسات كيميائيا بالكحول بنسبة 70٪ قبل إدخالها في الآبار. يتم قياس إدراج الخلايا الفارغة والعضوية ، ويتم حساب قيم TER. يتم تحديث الوسط لاحقا في كل من الغرف القمية والقاعدية الجانبية ، ويتم تصور ثقافة الكلاب العضوية على الإدراج باستخدام المجهر الضوئي. يتم ملاحظة الدموع في الثقافة العضوية أو الغشاء المسامي الدقيق والتعامل معها وفقا للبروتوكول. اختصار: TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قياس قيمة TEER
ملاحظة: يتم إجراء قياسات قيمة TEER باستخدام مقياس فولت/أوم ظهاري مع ملحق عيدان تناول الطعام. راجع تعليمات الشركة المصنعة للاستخدام. توفر قيم TEER معلومات حول سلامة الطبقة الأحادية العضوية للكلاب.- خذ قياسات قيمة TEER في كل يوم بديل أثناء نمو زراعة الخلايا.
- انقل مقياس فولت/أوم الظهاري وأقطاب كهربائية إلى خزانة السلامة الأحيائية. تعقيم الأقطاب الكهربائية كيميائيا في 70٪ من الكحول قبل الاستخدام. اضبط الوظيفة على Ohms. انتظر دقيقة واحدة على الأقل حتى تجف الأقطاب الكهربائية.
- قبل إجراء القياس الأول ، أدخل قطب السلك في المنفذ وقم بتشغيل الطاقة. تأكد من أن العداد يعرض 1000 Ω باستخدام القطب الكهربائي السلكي بدلا من قياس عيدان تناول الطعام. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط الجهاز.
- أدخل الأقطاب الكهربائية في الغرفة القمية والقاعدية للإدراج الخالي من الخلايا (فارغ) ، بحيث تحتوي الغرفة القمية على القطب الأقصر، وتحتوي الغرفة القاعدية على القطب الأطول (كما هو موضح في الشكل 4). لا تلمس الغشاء ، ولكن في الوقت نفسه ، تأكد من غمر الأقطاب الكهربائية في الوسط.
- انتظر لبضع ثوان حتى تستقر القيمة ولاحظ القيمة في دفتر المختبر. قم بقياس الطبقات الأحادية العضوية المتبقية من الكلاب ، مع التأكد من تعقيم الأقطاب الكهربائية بالكحول بنسبة 70٪ عند قياس عينات مختلفة. احرص على عدم لمس الطبقة الأحادية العضوية مع القطب الكهربائي.
- بعد أخذ القياسات ، قم بتعقيم الأقطاب الكهربائية بالكحول بنسبة 70٪ للمرة الأخيرة. تأكد من حمايتها من التلف الناجم عن التلاعب غير المناسب وتخزينها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- احسب قيم TEER لكل بئر باستخدام Eq (1) ، حيث تكونعينة R و Rفارغة هي قيم أوم (Ω) من الآبار أحادية الطبقة والفارغة ، على التوالي ، والمساحة (cm²) هي مساحة الإدراج.
(1)
- صيانة أحادية الطبقة
ملاحظة: راجع خطة التغيير المتوسط الموصى بها في الجدول 2.- باستخدام ماصات باستور المعقمة التي يمكن التخلص منها مقاس 9 بوصات وشفاط فراغ ، قم بشفط الوسط بلطف من الغرف القمية ثم القاعدية. قم بإمالة اللوحة لرؤية السطح المتوسط بوضوح. تجنب الشفط بالقرب من الغشاء المسامي الدقيق في الغرفة القمية لمنع تلف الطبقة الأحادية للخلية.
ملاحظة: استخدم ماصة باستور جديدة عند التنقل بين العينات. الماصات هي أيضا بديل محتمل لهذا الإجراء. - أضف ببطء CMGF + R / G باستخدام ماصات P1000 التي تهدف إلى جدار من الغرفة القمية أو القاعدية. قم بإجراء التغيير المتوسط في الغرفة القمية بعناية فائقة لتجنب إتلاف الطبقة الأحادية.
- تحقق من الآبار كل يومين تحت المجهر الضوئي ، وتقييم صحة الثقافة ومراقبة الدموع في الطبقة الأحادية العضوية أو الغشاء المسامي الدقيق. استخدم الفحص المجهري لتباين الطور لتسليط الضوء على تفاصيل الثقافة.
ملاحظة: في حالة تمزق الكلاب العضوية أحادية الطبقة ، يتم إعطاء الطبقة الأحادية الوقت للتعافي وإعادة النمو. في حالة تمزق الغشاء المسامي الدقيق ، يجب استبعاد البئر من التجربة.
- باستخدام ماصات باستور المعقمة التي يمكن التخلص منها مقاس 9 بوصات وشفاط فراغ ، قم بشفط الوسط بلطف من الغرف القمية ثم القاعدية. قم بإمالة اللوحة لرؤية السطح المتوسط بوضوح. تجنب الشفط بالقرب من الغشاء المسامي الدقيق في الغرفة القمية لمنع تلف الطبقة الأحادية للخلية.
(1)الجدول 2: توصية تغيير وسائل الإعلام للثقافات العضوية. يتم تغيير CMGF + R / G في الغرفة القمية والقاعدية للآبار كل يومين في كل يوم بديل. تتطلب فترة الثقافة الأطول خلال عطلة نهاية الأسبوع زيادة حجم الوسط في كل من الغرف القاعدية والقمية ، والتي يتم تطبيقها بعد ظهر يوم الجمعة وتغييرها يوم الاثنين. الاختصارات: ROCK = كيناز مرتبط ب rho. GSKiβ = الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا; CMGF + R / G = وسط كامل مع عوامل نمو معززة بمثبط ROCK و GSKiβ. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
3. بروتوكول تجريبي للنفاذية
ملاحظة: يصف القسم التالي (الخطوات 3.1-3.5) البروتوكول التجريبي للنفاذية. يتم تلخيص سير عمل البروتوكول التجريبي لقياس نفاذية الدواء في المختبر في الشكل 5.
الشكل 5: سير عمل البروتوكول التجريبي. يجب تغيير الوسط العضوي من CMGF + R / G إلى CMGF + بين ثمانية إلى اثني عشر يوما بعد بذر الإدخالات ، مما يسمح بالتمايز الخلوي. بعد تغيير الوسط (القمي والقاعدي الجانبي) إلى CMGF + ، يجب أن تظل قيم TEER في ازدياد ، مع وصول الطبقة الأحادية العضوية للكلاب تقريبا إلى التقاء. بعد أربعة أيام على الأقل من تغيير الوسط إلى CMGF + ، يتم تقييم جاهزية الطبقات الأحادية. عندما يتم تشكيل الطبقة الأحادية بالكامل ، وتصل قيم TEER إلى مرحلة الهضبة (عادة ما بين 1500 و 2500 Ω.cm2) ، يتم استبدال الوسط بمخزن النقل المؤقت لمدة 30 دقيقة للسماح للطبقة الأحادية بالتكيف مع البيئة الجديدة. في الوقت الذي تستغرق فيه 0 دقيقة من التجربة ، يتم إجراء فحص FITC-dextran ، ويتم جمع العينة القاعدية لمدة 20 دقيقة. يتم تحليل النتائج لاحقا على قارئ اللوحات. بعد التجربة ، يتم تغيير محتويات الغرفة القمية والقاعدية مرة أخرى إلى CMGF + ، ويتم أخذ قراءات قيمة TER. يتم احتضان الطبقات الأحادية لمدة 24 ساعة ، ويتم تقييم سلامة الطبقة الأحادية من خلال قياسات TEER المتكررة. الاختصارات: TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. ROCK = كيناز مرتبط ب rho; GSKiβ = الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا; CMGF + R / G = وسط كامل مع عوامل نمو معززة بمثبط ROCK و GSKiβ ؛ CMGF+ = وسط كامل مع عوامل النمو ولكن بدون مثبط ROCK أو GSKiβ ؛ FITC = الفلوريسين إيزوثيوسيانات. F = التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تقييم جاهزية الطبقة الأحادية العضوية
ملاحظة: تحدث هذه الخطوة بعد 8-14 يوما من البذر.- تحقق من الطبقة الأحادية على الأقل كل يومين تحت المجهر الضوئي (استخدم تباين الطور لتصور سلامة الطبقة الأحادية). استمر في الخطوة التالية عندما تتشكل الطبقة الأحادية للخلية بالكامل دون فجوات أو علامات واضحة على الدموع.
- قم بتغيير الوسط العضوي من CMGF + R / G إلى CMGF + (باستثناء مثبط ROCK و GSKiβ من التركيب المتوسط). يوصى بتبديل الوسيط قبل أربعة أيام على الأقل من التجربة.
ملاحظة: ستسمح هذه الخطوة بالتمايز السليم للطبقة الأحادية العضوية. - استمر في قياس قيم TEER كل يومين تقريبا. عندما تبدأ قيم TEER في الاستقرار عند حوالي 1,500 إلى 2,000 Ω × سم مربع (الشكل 6)، قم بقياس قيم TEER كل يوم.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على هذه الحالة الثابتة لمدة 2-3 أيام تقريبا ، وهي النافذة الزمنية المثلى لإجراء اختبار النفاذية (عادة في الأيام من 11 إلى 13). قد تتأرجح قيم TEER الهضبة قليلا بناء على التوطين المعوي للعضويات ، ودرجة حرارة القياس ، والسلالة ، والعمر ، والحالة المرضية للكلب. - قم بجدولة فحص نفاذية الدواء على الفور لتجنب الانخفاض السريع في قيم TEER أو فرط نمو الطبقة الأحادية العضوية إلى طبقات خلايا متعددة.
- التحضير للتجربة
ملاحظة: يمكن استخدام هزازات الحاضنة أثناء التجربة لتجنب تأثيرات طبقة الماء غير المتحركة. قم بقياس قيم TEER في درجات حرارة ثابتة.- في يوم التجربة، قم بقياس قيم TEER وتأكد من أن القيم وصلت إلى حالة مستقرة ولا تنخفض بسرعة.
- اختر أفضل الطبقات الأحادية (عبر المجهر الضوئي وقيم TER) من بين الإدخالات الزائدة بنسبة 20٪ لإجراء التجربة.
- راقب الطبقات الأحادية تحت المجهر الضوئي واستبعد الطبقات الأحادية العضوية غير المكتملة أو الممزقة أو المتضخمة.
- قم بإعداد مخزن النقل المؤقت واضبط الرقم الهيدروجيني الخاص به إلى القيم المطلوبة.
ملاحظة: يختلف تكوين المخزن المؤقت التجريبي استنادا إلى الإعداد التجريبي. يتكون المخزن المؤقت المستخدم بشكل متكرر من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، والجلوكوز (12.5 ملليمتر) ، و 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثانسلفونيك (HEPES ، 25 mM). يضمن هذا التكوين بقاء الثقافة العضوية أثناء التجربة. - استنشق الوسط بعناية من الغرف القمية والقاعدية الجانبية للآبار المختارة.
- أضف 200 ميكرولتر من مخزن النقل العازل إلى الغرفة القمية و 800 ميكرولتر إلى الغرفة القاعدية.
ملاحظة: يجب أولا إضافة المخزن المؤقت للنقل إلى الغرفة القمية ثم إلى الغرفة القاعدية لتجنب انفصال الطبقة الأحادية عن الغشاء المسامي الدقيق. - ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ CO2 الغلاف الجوي) لمدة 30 دقيقة لتحقيق التوازن.
ملاحظة: أصبحت الطبقات الأحادية العضوية للكلاب جاهزة الآن لتجربة نفاذية الدواء.
- تخطيط تجريبي نموذجي - حل تركيز IgY
ملاحظة: قد يتغير التصميم والتخطيط التجريبيان اعتمادا على سؤال البحث. يتم استخدام نفاذية الغلوبولين المناعي Y (IgY) من خلال طبقة أحادية العضوية في البروتوكول كمثال ويمكن تعديلها. يشير مصطلح غرفة المتبرع إلى الغرفة التي يتم فيها تطبيق الدواء في البداية ، بينما تشير غرفة الاستقبال إلى الغرفة التي تقبل الدواء من غرفة المتبرع. تجمع التجربة النموذجية عينات في غرف الاستقبال على مدار 2 ساعة (على سبيل المثال ، 15 ، 30 ، 60 ، 90 ، 120 دقيقة).- تحضير محلول IgY (الدواء أو المذاب المفضل) عن طريق إذابته في مخزن النقل العازل إلى التركيز النهائي المطلوب. تحضير محلول دوائي أكثر من اللازم.
ملاحظة: يمكن أولا إذابة الأدوية ذات الذوبان المائي المنخفض في مذيب عضوي (مثل الإيثانول ، DMSO) قبل إضافتها إلى المخزن المؤقت. يجب أن يكون التركيز النهائي للمذيب أقل من 1٪ حتى لا يتلف الطبقة الأحادية للخلية. - قم بإزالة المخزن المؤقت من غرفة المتبرع (إما الغرفة القمية أو القاعدية) لكل بئر.
- أضف محلول IgY (محلول دوائي) إلى جميع غرف المانحين. استخدم المحلول المتبقي كمحلول مانح الوقت 0 لقياس تركيز الدواء الأولي.
- في النقاط الزمنية المطلوبة ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من غرفة الاستقبال وضعها في أنبوب ملصق. في آخر نقطة زمنية ، قم بإزالة عينة من غرفة المانحين. في نهاية التجربة ، انقل أليكوتس المتبرع والمستقبل إلى ثلاجة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى العديد من النقاط الزمنية ، فقد يتم استبدال المخزن المؤقت في غرفة الاستقبال ولكن يجب حسابه في حساب النفاذية الظاهرة. يجب ألا يصل التركيز في غرفة الاستقبال إلى أكثر من 10٪ من غرفة المتبرع في نهاية التجربة للحفاظ على ظروف الحوض44.
- تحضير محلول IgY (الدواء أو المذاب المفضل) عن طريق إذابته في مخزن النقل العازل إلى التركيز النهائي المطلوب. تحضير محلول دوائي أكثر من اللازم.
- مراقبة جودة الطبقة الأحادية الخلية العضوية
ملاحظة: يمكن استخدام حل FITC-dextran لتأكيد سلامة الطبقة الأحادية أثناء التجربة. يستخدم FITC-dextran كمثال على فحص سلامة الطبقة الأحادية. وتشمل الأنواع الأخرى الأصفر لوسيفر ، PEG-4000 ، مانيتول المسمى إشعاعيا ، والأنسولين44.- في الوقت المناسب 0 دقيقة ، قم بشفط محتويات الغرفة القمية واستبدلها ب 250 ميكرولتر من محلول FITC-dextran (5 ملغ / مل ، 4 كيلو دال) في ثلاثة أضعاف لكل مجموعة تجريبية.
ملاحظة: لا تعرض FITC-dextran للضوء. - بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الغرفة القاعدية.
- قم بقياس شدة التألق للعينة القاعدية باستخدام قارئ لوحة التألق (استخدم منحنى المعايرة ؛ تعيين الإثارة عند 485 نانومتر وقيمة الانبعاثات عند 528 نانومتر).
ملاحظة: يمكن أيضا حسابتطبيق P الخاص ب FITC باستخدام الطريقة الموضحة في المناقشة. - بعد انتهاء التجربة ، استنشق بعناية المخزن المؤقت الزائد من الغرف القمية والقاعدية.
- أضف 200 ميكرولتر من CMGF + في الغرفة القمية و 700 ميكرولتر إلى الغرفة القاعدية.
- قياس قيم TEER في الآبار الفردية.
- ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ CO2 الغلاف الجوي) لمدة 24 ساعة.
- إذا كان ذلك ممكنا ، بعد 24 ساعة ، قم بقياس قيم TEER لتقييم الضرر المحتمل للطبقة الأحادية أثناء جزء مراقبة الجودة من التجربة. استخدم المجهر الضوئي لتصور سلامة الطبقة الأحادية العضوية للكلاب.
- في الوقت المناسب 0 دقيقة ، قم بشفط محتويات الغرفة القمية واستبدلها ب 250 ميكرولتر من محلول FITC-dextran (5 ملغ / مل ، 4 كيلو دال) في ثلاثة أضعاف لكل مجموعة تجريبية.
- إصلاح الطبقات الأحادية للخلية للتحليل النهائي
- تحضير محلول حمض الخليك والكحول الفورمالين (FAA ، التركيب في الجدول 1).
- قم بإزالة مخزن النقل المؤقت أو CMGF+ من الغرف القمية والقاعدية باستخدام ماصة P1000 أو ماصات باستور معقمة يمكن التخلص منها مقاس 9 بوصات وشفاط فراغ.
- املأ الغرف القمية والقاعدية ب FAA.
- بعد 24 ساعة ، استنشق FAA واستبدله بالإيثانول بنسبة 70٪.
- لف اللوحة بفيلم مختبر مرن لمنع التبخر والمضي قدما في منع التحضير.
الشكل 6: قيم TEER عبر المجموعات التجريبية. تم قياس قيم TEER في خمس مجموعات من الطبقات الأحادية العضوية المعوية للكلاب. تألفت ثلاث مجموعات من الأمعاء الصائم للكلاب ، وتألفت مجموعتان من القولون. تضمنت كل مجموعة 12 إلى 22 نسخة متماثلة. يتم عرض قيم TEER للثقافات المعوية الصونجية من اليوم 4 إلى اليوم 14 ، وتظهر مزارع القولون من اليوم 4 إلى اليوم 12 (انتهت القياسات عندما وصلت الطبقة الأحادية العضوية إلى قيم الحالة الثابتة ، مما يشير إلى أن الطبقة الأحادية كانت جاهزة للاستخدام التجريبي). تعبر أشرطة الخطأ عن SEM للقياسات. اختصار: TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
وقد سبق وصف إجراءات التشغيل الموحدة لاستزراع الكلاب العضوية33، كما نوقش بروتوكول الكلاب العضوي بالتفصيل في هذا العدد الخاص38. تم تثبيت المواد العضوية المعوية للكلاب المستزرعة على دعامات نفاذة ومدمجة بالبارافين لفحص التشريح الدقيق للطبقة الأحادية ومجموعات الخلايا. وقد سبق أن ناقش غابرييل وآخرون عملية تضمين البارافين. تم إجراء تلطيخ روتيني (الهيماتوكسيلين والإيوسين) ، وتم استخدام تقنية تلطيخ Alcian Blue للكشف عن خلايا الكأس في الطبقة الأحادية العضوية للكلاب (انظر الشكل 7).
الشكل 7: تلطيخ الكلاب العضوية المعوية أحادية الطبقة. تم تضمين البارافين العضوي المعوي للكلاب من أصل القولون في الدعم القابل للنفاذ وملطخة ب H & E و AB. تم التقاط صور تمثيلية باستخدام الفحص المجهري الخفيف عند تكبير 40x (A) و 60x (B). يكشف تلطيخ H&E عن طبقة أحادية ظهارية عمودية ، ويمكن ملاحظة الزغابات الدقيقة في الجزء القمي من الخلايا عند تكبير 60x. AB تلطيخ يكشف النقاب عن وجود خلايا الكأس (الأزرق الداكن) في الطبقة الأحادية العضوية المعوية الكلاب. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (A)، 50 ميكرومتر (B). الاختصارات: H & E = الهيماتوكسيلين والإيوزين. AB = الأزرق السيان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يجب زراعة الثقافة العضوية على الدعم القابل للنفاذ لمدة 10 إلى 14 يوما لتكون جاهزة لتجربة النفاذية. يستخدم الفحص المجهري الضوئي بالاقتران مع قياسات قيمة TEER لتأكيد استعداد الثقافة العضوية لاختبار نفاذية الأدوية المرشحة. يتم عرض الصور المجهرية الخفيفة التمثيلية لمختلف الطبقات الأحادية العضوية المعوية للكلاب من الحيوانات السليمة والمريضة في الشكل 8.
الشكل 8: المجهر أحادي الطبقة العضوية المعوية للكلاب. صور الطبقات الأحادية المتنامية كما تظهر تحت المجهر الضوئي. يتم تمثيل الطبقات الأحادية العضوية المشتقة من المتبرعين الأصحاء بمزارع الأمعاء الصولجان (10x ؛ 40x) والقولون (20x ؛ 40x). يتم تمثيل الطبقات الأحادية العضوية من المتبرعين المرضى بواسطة الاثني عشر (5x ؛ 10x) واللفائفي (5x ؛ 10x) المعوية المشتقة من مريض الكلاب الذي تم تشخيصه ب PLE. كل من الثقافات العضوية PLE هي أمثلة على عزل الخلايا غير السليم أثناء بذر المواد العضوية ، ولا يمكن استخدام هذه الثقافات لمقايسات نفاذية الدواء بسبب وجود عضويات 3D. أمثلة على الانحرافات عن تكوين الطبقة الأحادية المناسبة ، مثل الدموع أحادية الطبقة (5x) ، ناتجة عن التلاعب غير الدقيق بالعينات البيولوجية. تحدث الثقافة المطولة للعضويات (10x ؛ 20x) بسبب الصيانة الطويلة للعضويات على الإدراج عندما تبدأ المواد العضوية في التشبه بهيكلها الأصلي ثلاثي الأبعاد. للمقارنة ، يتم تقديم صور لخطوط الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية على الدعامات النفاذة المستخدمة بشكل شائع في دراسات نفاذية الدواء (MDCK-10x ؛ 40x ، و Caco-2-10x ؛ 20x). الاختصارات: PLE = اعتلال الأمعاء الخاسر للبروتين. MDCK = كلية الكلاب في مدينة داربي. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر (5x) ، 200 ميكرومتر (10x) ، 100 ميكرومتر (20x) ، 50 ميكرومتر (40x). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كما تم إصلاح الطبقات الأحادية العضوية في 3٪ Paraformaldehyde-3٪ Glutaraldehyde في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تم استخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) لتوصيف البنية الفائقة للثقافة العضوية على الدعامات القابلة للنفاذ. يمكن رؤية الهياكل التشريحية الدقيقة للزغب الصغير والتقاطعات الضيقة في الشكل 9.
الشكل 9: صور TEM للطبقات الأحادية العضوية المعوية للكلاب الصحية. تم استخدام TEM للكشف عن البنية الدقيقة الخلوية للطبقات الأحادية العضوية الصولجان (A) واللفائفي (B) والقولوني (C). يتم تمييز الغشاء المسامي الدقيق لإدراج الدعم القابل للنفاذ بسهم أصفر. يتم تحديد وجود الزغابات الدقيقة (السهم الأزرق) والتقاطعات الضيقة (السهم الأحمر) في الصور. اختصار: TEM = المجهر الإلكتروني الناقل. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر (A) ، 2 ميكرومتر (B ، C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يجب إجراء كل من قياسات TEER والفحص المجهري الضوئي للتأكد من أن النظام جاهز لاختبار النفاذية. الفحص جاهز للاستخدام عندما يصل TEER إلى حالة مستقرة ، في حين أن الفحص المجهري الخفيف سيساعد على استبعاد تلف أو فرط نمو المواد العضوية. يتم تقديم ملخص لقياسات TEER النموذجية لخمس مجموعات تتكون من الأمعاء الصائم للكلاب والقولون في الشكل 6.
الجدول 1: تكوين الوسائط العضوية و FAA. يتم تلخيص التكوين الكامل ل CMGF + و CMGF + R / G و FAA في هذا الجدول. الاختصارات: ROCK = كيناز مرتبط ب rho. GSKiβ = الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا; CMGF + R / G = وسط كامل مع عوامل نمو معززة بمثبط ROCK و GSKiβ ؛ CMGF+ = وسط كامل مع عوامل النمو ولكن بدون مثبط ROCK أو GSKiβ ؛ FAA = الفورمالين حمض الخليك الكحول; EGF = عامل نمو البشرة. هذا الجدول مقتبس من 38. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول التكميلي 1: جدول لتدوين الملاحظات على الكلاب العضوية نظام الدعم النفاذية. الاختصارات: TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. ROCK = كيناز مرتبط ب rho; GSKiβ = الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا; CMGF + R / G = وسط كامل مع عوامل نمو معززة بمثبط ROCK و GSKiβ ؛ CMGF+ = وسط كامل مع عوامل النمو ولكن بدون مثبط ROCK أو GSKiβ. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Discussion
تعد مزارع الكلاب العضوية المعوية في جهاز الدعم القابل للنفاذ مفهوما فريدا يربط بين اختبارات نفاذية الدواء التقليدية40 ورواية في نموذج الكلاب المختبري 41. يمكن استخدام أنواع مختلفة من المواد العضوية المعوية للكلاب وتقييمها بناء على الهدف من التجربة مع الحد الأدنى من التعديلات. يوصى باختبار تركيزات متعددة من الدواء ذي الأهمية في 3-4 آبار لكل مجموعة. قد تستند التركيزات إلى التركيز المعوي المتوقع للدواء. علاوة على ذلك ، قد يساعد استخدام الأبحاث السابقة في تحديد النقاط الزمنية المناسبة لتصميم الدراسة. يجب إجراء التوثيق المناسب لتصميم الدراسة لزيادة قابلية التكرار والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
هذه التكنولوجيا لديها العديد من القيود بسبب حداثة الطريقة42 ، ويرجع ذلك في الغالب إلى عدم وجود توحيد في التصميم التجريبي وتنفيذ البروتوكول عبر المختبرات. وقد اعترفت المجموعات الأخرى43 بهذا النقص في التوحيد القياسي، وستؤدي بروتوكولات الكلاب أحادية الطبقة العضوية ثلاثية الأبعاد إلى إمكانية التكرار بين المختبرات وإدخال التوحيد القياسي على هذا النظام. تعمل النهج الموحدة لتحليل البيانات على تحسين قابلية التكرار ويمكن أن تعزز نتائج اختبار المخدرات الأولي باستخدام عضويات الكلاب في نظام الدعم القابل للنفاذ عبر المختبرات المختلفة. يفتقر نموذج الكلاب العضوي ثلاثي الأبعاد أيضا إلى مجموعات البيانات التي تقارن في المختبر P قيمتطبيق الأدوية النموذجية بامتصاص الأمعاء البشري أو الكلاب في الجسم الحي ، مثل خلايا Caco-244,45,46. بمجرد إنشاء هذه البيانات ، يمكن استخدام هذا النموذج العضوي للكلاب لتقييم نفاذية الأمعاء أثناء تطوير الدواء.
من الأهمية بمكان توخي الحذر عند بذر المواد العضوية على نظام الدعم النافذ لزرع كثافة عالية بما فيه الكفاية من الخلايا المنفصلة بشكل مناسب. تكون قيم TEER للنظام أكثر موثوقية وقابلة للتكرار عند زراعتها في طبقات أحادية صارمة. يمكن أن تؤدي الثقافة المطولة للطبقات الأحادية إلى زيادة هائلة في قيم TEER التي تصل إلى أبعد من القيم الفسيولوجية للأمعاء. ثم تظهر أقسام H & E من هذه الهياكل 3D عدة طبقات من الخلايا فوق بعضها البعض مع هياكل متغيرة من الخلايا المعوية أقرب إلى الغشاء.
بعد التوسع الناجح في الطبقة الأحادية العضوية المعوية للكلاب ، يمكن تحليل النتائج بنفس طريقة مقايسات الخلايا 2D التقليدية عن طريق حساب معامل النفاذية الظاهر للدواء (Papp) الصيغة44. تصف قيمةتطبيق P (انظر Eq (2)) معدل النقل عبر الطبقة الأحادية الخلوية47.
(2)
هو الميل الأولي للتركيز مقابل منحنى الوقت (على سبيل المثال ، نانومول / ثانية). A هي مساحة الإدراج (سم2) ، و C0 هي التركيز الأولي للدواء أو المركب في غرفة المتبرع37. يعد الاعتراف الموثوق به بسلامة الطبقة الأحادية جزءا مهما من اختبار النفاذية الذي يتطلب التوحيد القياسي. يوصى بإجراء الفحص المجهري الضوئي وقياسات TEER لتقييم عضويات الكلاب في نظام دعم قابل للنفاذ والمساعدة في تحديد التوقيت الصحيح للتجربة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام علامات النفاذية الجزيئية الصفرية (على سبيل المثال ، FITC-dextran ، أصفر لوسيفر ، PEG-400) لتقييم سلامة الطبقة الأحادية العضوية وظيفيا. يجب الانتباه إذا كان المركب الذي تم اختباره متأثرا بالناقل. يستخدم P-glycoprotein (P-gp) كمثال شائع لمضخة التدفق السائل. يجب إنشاء نسبة تدفق النفايات السائلة (P app ، BL-AP / Papp ، AP-BL) مقارنة بركيزة مسبارP-GP المعروفة.
المجهر الضوئي (عادي أو محسن مع تباين الطور) هو طريقة لا تقدر بثمن للتحقق من سلامة الطبقة الأحادية 2D أو 3D وإدراج المرشح أثناء تقييم النمو الزائد الخلوي المحتمل. يمكن أن يكون الشكل 7 بمثابة دليل للتعرف على مزارع الخلايا العضوية المعوية الصحية للكلاب. قيم TEER هي مقياس مهم لتشكيل التقاطعات بين الخلايا والتمايز بين الثقافات العضوية في ظهارة معوية سليمة. تتمايز الخلايا العضوية المعوية للكلاب إلى خلايا معوية وخلايا كأسية (الشكل 6). تسمح هذه الخلايا المنتجة للمخاط بدراسة تفاعلات الدواء والمخاط ، والتي كان من الصعب تحقيقها باستخدام مزارع الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد48. تم تأكيد وجود خلايا الغدد الصماء المعوية سابقا في الخلايا العضوية المعوية للكلاب بواسطة Chandra et al.33.
يتم توفير مزيد من التوصيف للطبقات الأحادية العضوية للكلاب المشتقة من المواد العضوية الصائم واللفائفي والقولوني باستخدام TEM. تظهر صور TEM البنية الدقيقة الخلوية ، بما في ذلك التقاطعات الضيقة وتشكيل الزغابات الدقيقة ، مما يوضح بشكل أكبر تعقيد وفائدة هذه النماذج العضوية في الطب الانتقالي. استنادا إلى النتائج التجريبية ، كانت الثقافات العضوية على الدعم القابل للنفاذ جاهزة للتجريب بين الأيام 11 واليوم 13 بعد البذر (الشكل 9). تراوحت قيم TEER في هذه المرحلة الزمنية بين 1,500 و 2,500 Ω.cm2. تستمر مرحلة الهضبة لقيم TEER لفترة زمنية محدودة للغاية حيث يجب بدء التجربة قبل أن تبدأ قيم TEER في الانخفاض ببطء. يمكن أن تكون قيم TEER أيضا جزءا حاسما من عرض النتائج التجريبية المهمة حيث قد تتفاعل بعض الأدوية أو سواغات المنتجات الدوائية مع الطبقة الأحادية (على سبيل المثال ، التقاطعات الضيقة) ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على قراءات قيمة TIER. هذا وحده يمكن أن يكون بمثابة بيانات لتجربة.
يمكن تطبيق المواد العضوية المعوية للكلاب في جهاز زراعة الخلايا ثنائي الغرفة في مجالات أخرى غير نفاذية الدواء عن طريق الفم بسبب البنية الفريدة للطبقة الأحادية الناتجة عن الخلية. على سبيل المثال ، يمكن استخدامها في أبحاث علم الأحياء الدقيقة (على سبيل المثال ، تأثير تغيير النباتات الميكروبية GI) ، ودراسات امتصاص الفيروسات ، والتفاعلات الدوائية الدوائية ، وآليات نقل الأدوية49. عادة ما تمتلئ غرفة المتبرع بعقار الاختبار أو المركب الذي تختاره ، ويتم أخذ الاقتباسات من غرفة الاستقبال في نقاط زمنية مختلفة. يمكن تحليل هذه الأليكوتوغرافيا باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، أو قياس الطيف الكتلي ، أو فحص الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، أو تقنيات أخرى لتحديد الكمية والسرعة التي يتخلل بها المذاب من خلال الطبقة الأحادية.
تتطلب هذه الدراسات طبقة أحادية سليمة لتقييم نفاذية الدواء بدقة. وهذا يتطلب عادة زراعة طبقات أحادية اللون تتجاوز تلك اللازمة لحساب الآبار غير الصالحة للاستخدام. يمكن أيضا استخدام الطبقات الأحادية للخلايا العضوية لقياس الامتصاص الفيروسي إما من الجانب القمي أو القاعدي للطبقة الأحادية ، مع قراءات تشمل مقايسات التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة للكشف عن الامتصاص الخلوي للفيروس. وأخيرا، يمكن تطبيق عقاقير متعددة (أي الركيزة والمثبطات) على غرفة المتبرع لتحديد التفاعلات الدوائية القائمة على الناقل.
واستنادا إلى الملاحظات الحالية، لن تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق فقط على الكلاب العضوية في إدراج المستزرعة، ولكنها ستكون مناسبة أيضا للأنواع البيطرية الأخرى وأنظمة الأعضاء، مع الحاجة إلى تعديلات طفيفة لتناسب الأنواع أو نموذج الأعضاء الذي تختاره على أفضل وجه. كان لا بد من تعديل بروتوكولات النمو العضوي المعوي للكلاب بناء على الخصائص الفريدة للثقافة. وبالتالي ، يمكن تعديل البروتوكول إلى نوع آخر ولكنه سيتطلب تغييرات طفيفة على البروتوكول. قد تبدأ التعديلات بتغييرات في كثافة بذر الخلايا وتتوسع إلى تغييرات في تكوين الوسائط للتمييز بشكل صحيح بين المواد العضوية ذات الاهتمام.
يعد التوحيد القياسي والتوثيق التفصيلي للإجراءات التجريبية والرصد المتسق للطبقات الأحادية للخلية ممارسات حاسمة مطلوبة عبر اختبارات الدعم القابلة للنفاذ ولا تقتصر على نظام الكلاب. هذه الأنواع المحتملة أو تعديلات الأعضاء حاسمة للتوثيق والإبلاغ عن المزيد من التقدم في هذا المجال. يحتوي هذا النموذج على العديد من القيود ، على سبيل المثال ، متطلبات التكلفة ، والتباين بين المختبرات ، والبيانات المحدودة حول القدرة على التنبؤ بامتصاص الأمعاء في الجسم الحي. الكلاب ، في بعض الحالات ، تمتلك ناقلات أدوية مختلفة وإنزيمات استقلاب من البشر50.
علاوة على ذلك ، يجب اختبار نظام الكلاب العضوي على مجموعة متنوعة من الأجهزة الأخرى ثنائية الغرفة من الشركات المصنعة الأخرى لتحديد مدى ملاءمة مثل هذا النموذج (على سبيل المثال ، يجب تحديد مدى ملاءمة تركيبات غشاء المرشح المختلفة). عيب آخر هو أن جزء تجربة نفاذية الدواء من المخطوطة أقل وصفية من الأجزاء السابقة. يحدث هذا بسبب وجود فائض من المعلومات في هذا المجال. كان الهدف من هذا الجزء من المخطوطة هو وصف هذه الأساليب بطريقة قابلة للتعديل مع عدم قطع حواف الركائز الأساسية لهذه التجارب. تم جمع معلومات أكثر تفصيلا عن تجارب النفاذية بواسطة Hubatsch et al.37. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الإدخالات القابلة للنفاذ في تجارب الزراعة المشتركة وهجرة الخلايا وفحص الغزو4.
في الختام ، فإن المواد العضوية المعوية للكلاب في أجهزة الاستزراع ثنائية الغرفة لديها القدرة على استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك المجالات الطبية الحيوية والطب الانتقالي ، على سبيل المثال لا الحصر. تنشئ البروتوكولات العديد من الاستراتيجيات لتخطيط تجربة وتعزيز موثوقية البيانات بين المختبرات للنماذج العضوية عبر مجال علم الأحياء.
Disclosures
K. Allenspach هو المؤسس المشارك ل LifEngine Animal Health و 3D Health Solutions. وهي تعمل كمستشارة ل Ceva Animal Health و Bioiberica و LifeDiagnostics و Antech Diagnostics و Deerland Probiotics و Mars. J.P. Mochel هو المؤسس المشارك لشركة LifEngine Animal Health و 3D Health Solutions ويعمل كمستشار ل Ceva Animal Health و Ethos Animal Health. تعكس هذه المقالة آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل تأييد إدارة الغذاء والدواء أو وجهة نظرها أو سياساتها. المؤلفون الآخرون ليس لديهم أي تضارب في المصالح للإعلان.
Acknowledgments
نود أن نعرب عن امتناننا لمختبر التشخيص البيطري لموظفي جامعة ولاية أيوا ، وهم هالي لامبرت ، إميلي راهي ، روزالين برانامان ، فيكتوريا غرين ، وجنيفر غرولتز ثراش ، لمعالجة العينات في الوقت المناسب. نود أيضا أن نشكر جودي سميث وبيثان فالنتاين على توفير المواد لتجارب النفاذية. نود أيضا أن نشكر ديفيد دياز ريغان على مساعدته في الشكل 9. باستثناء الشكل 6 ، تم إنشاء جميع الأرقام في BioRender.com. يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من بدء تشغيل أعضاء هيئة التدريس ، وجائزة ISU VPR Miller ، وجائزة ISU VPR Miller ، والجائزة الفرعية NSF SBIR إلى ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
- Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
- Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
- Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
- Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
- Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
- Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
- Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
- Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
- Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
- Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
- Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
- Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
- Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
- Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
- Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
- Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
- Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).
