여기에서, 우리는 바다 말미잘에서 조독 추출물을 얻고 용혈성 및 포스포리파제 활성을 검출하는 프로토콜을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
바다 말미네 독 조성물은 폴리펩티드 및 비단백질 분자를 포함한다. 세포 용해 성분은 새로운 분자 도구를 설계하기위한 높은 생명 공학 및 생물 의학적 잠재력을 가지고 있습니다. 바다 말미잘독은 선충류라고 불리는 외배엽 및 하위 세포 구조의 선 세포에 위치하며, 둘 다 바다 말미잘의 몸 전체에 분포합니다. 이 특성은 세포와 선충류가 다른 독성이없는 분자와 함께 독 성분을 방출하기 위해 용해되어야하기 때문에 도전을 의미합니다. 따라서, 먼저, 독은 조추출물(다양하고 다양한 분자와 조직 파편들의 혼합물)로부터 유래된다. 다음 단계는 특정 생체활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 것이다. 여기에서, 우리는 시탈리신의 존재를 확인하기 위해 바다 말미네 조추출물 및 생물검정을 수득하기 위한 효율적인 전략을 기술한다. 첫 번째 단계는 시세포 분해신을 방출하는 저렴하고 간단한 기술 (교반 및 동결 해동 사이클)을 포함합니다. 우리는 가장 높은 세포 용해 활성과 단백질 (건조 중량 20g에서 단백질 ~ 500mg)을 얻었습니다. 다음으로, 추출물의 폴리펩티드 복잡성을 SDS-PAGE 겔 검출에 의해 분석하였고, 10 kDa 내지 250 kDa 사이의 분자량을 갖는 단백질을 검출하였다. 용혈성 분석에서 우리는 양 적혈구를 사용하고 HU50 (11.1 ± 0.3 μg / mL)을 측정했습니다. 대조적으로, 조 추출물에서 포스포리파아제의 존재는 아가로스를 갖는 고체 배지에서 기질로서 달걀 노른자를 사용하여 결정되었다. 전반적으로,이 연구는 효율적이고 저렴한 프로토콜을 사용하여 조 추출물을 준비하고 복제 가능한 생물 분석을 적용하여 세포 분해물, 생명 공학 및 생물 의학 관심사를 가진 분자를 확인합니다.
서론
해양 동물은 생물학적 활성 화합물의 풍부한 공급원입니다. 최근 수십 년 동안, 바다 말미잘독의 조성은 용혈성, 세포독성, 효소적(포스포리파제, 프로테아제, 키티나제) 및 단백질 분해 활성에 대한 신경독성 활성 및 억제 효과를 갖는 다양한 폴리펩티드를 포함하기 때문에 과학적인 관심을 끌었다1. 또한, 이들 폴리펩티드는 생명공학 및 치료적 용도2,3에서 분자 도구의 개발을 위한 잠재적 공급원이다.
바다 말미잘독과 그 분자 성분에 대한 보고는 거의 없는데, 이는 독을 얻는 복잡성, 심지어 독소의 분리 및 특성화로 인한 것이다. 보고서에 사용 된 추출 방법은 독 생산과 관련이 있고 관련이없는 세포의 내용물을 용해시키고 비우는 것을 포함했습니다1.
모든 cnidarians의 특별한 특징은 단일 해부학 적 영역에 집중 된 독의 생산 및 방출을위한 시스템이 없다는 것입니다. 대신, 선충류는 독 4,5를 유지하는 구....
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프로토콜
바다 말미잘은 멕시코 연방 정부의 양식, 수산 및 식품에 대한 국가위원회의 지침에 따라 수집되었습니다 (허가 번호 PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). 멕시코 국립 자치 대학 생명 공학 연구소의 생명 윤리위원회는 바다 말미잘을 이용한 모든 실험을 승인했습니다. 양 혈액 샘플은 동물 생산 및 건강 실무 교육 및 연구 센터 (CEPIPSA, 멕시코 국립 자치 대학)에서 구입했습니다.
1. 유기체 수집
- 바다 말미잘을 수집 A. dowii.
참고: 여기에서, 유기체는 멕시코주 캘리포니아주 엔세나다 바하 해안의 조간대 지역에서 썰물 기간 동안 수집되었다(그림 1A,B). - 생물을 바닷물이 있는 용기에 있는 실험실로 운반합니다(그림 1C).
- 실험실에서는 손으로 증류수로 유기체를 청소하여 신체에 부착되는 큰 기질 입자를 제거하십시오.
- 유기체를 즉시 -80°C에서 72시간 동안 울트라 냉동고에서 동결시킨다.
- 생물을 동결 건조를위한 특수 안경에 넣고 동결 건조 조건....
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결과
바다 말미잘의 조추출물을 얻기 위해 사용된 프로토콜의 대표적인 결과는 두 가지 기술(동결 및 해동의 교반 및 순환)을 결합하면 선충종을 효율적으로 배출할 수 있었으며 총 단백질 양은 500mg(8mg/mL)이었다(그림 3).
조 추출물의 단백질 복잡성은 SDS-PAGE 전기영동을 통해 10 kDa 및 250 kDa 초과로부터 관찰될 수 있었다. 또한, 시톨리신은 15 kDa 및 20 kDa의 분자량 영역에서 검출되었으며, 포스포리파아제13 또는 악티노포린 3에 상응할 수 있는 분자량의 범위였다(도 4).
동결 및 해동 주기 전과 동안 추출물의 용혈 활성은 100% 용혈까지 증가하였고, 마지막 두 사이클에서 총 조 추출물 단백질 중 50 μg.......
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토론
과학 및 산업의 다른 분야에서 응용 프로그램과 새로운 화합물에 대한 높은 수요는 독의 연구로 이어졌다. Venom은 새로운 분자 도구를 생성하기위한 주형 역할을하는 풍부한 분자 공급원을 나타냅니다. 그러나 이러한 독의 복잡성은 그것들을 얻고 연구하기 위해 다양한 방법의 구현과 조합을 필요로합니다.
여기에서, 우리는 동결건조된 표본으로 시작하여 다른 바다 말미잘의 독을 탐구하는 데 사용할 수 있는 바다 말미잘인 Anthopleura dowii, Verrill 1869의 독을 획득하고 분석하는 방법을 보여주고, 그 다음 조추출물 obtention. 동결건조 단계는 실험의 필요에 따라 사용될 때까지 그리고 샘플의 일부가 사용될 때까지 유기체를 보존하여 유기체의 효율적인 적용을 허용하고, 많은 수의 수집을 피하고, 단백질 안정성을 유지할 수있게했습니다 7,16. 신선.......
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공개 사항
저자들은 이 논문의 출판과 관련하여 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
이 작품은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)에 의해 지원되었으며, 보조금 번호 IT200819가 있습니다. 저자는이 원고의 영어 문법을 확인하기 위해 Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC에게 인정합니다. Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada)와 Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM)의 기술 지원. 우리는 또한 양의 피를 얻은 Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) 박사에게 감사드립니다. 우리는 특히 ICAT-UNAM의 José Saniger Blesa박사에게 비디오 녹화를 위한 실험실의 시설에 대해 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15mL 원추형 원심분리기 튜브 | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | , Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50mL 원추형 원심분리기 튜브 | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid, Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| 소 혈청 알부민 분획 V | 시그마 | A3059-100G | |
| Bradford 단백질 분석 | Bio-Rad | 5000006 | |
| 염화칼슘 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 세포 배양 플레이트 96 웰, V-bottom | Corning | 3894 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5804R | |
| 원심분리기 튜브 | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP 시스템 | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric | acid Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie brilliant blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| 포도당 | J.T. Baker | 1916-01 | |
| 덕트리스 인클로저 | Labconco | 수직 | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | 겔 문서화 시스템 | |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| 혈구계 | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53C | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. 베이커 | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. 베이커 | 3624-01 | |
| NaH2PO4. H2o | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin 소프트웨어 | 버전 9 | 시그모이드 조정으로 플롯을 설계하려면 | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 11836153001 | |
| 단백질 분석 염료 시약 농축액 | 바이오 라드 | 5000006 | |
| 로다민 6G | 시그마-알드리치 | 252433 | |
| SDS | 시그마-알드리치 | L4509 | |
| 구연산나트륨 이수화물 | JT 베이커 | 3646-01 | |
| 분광 광도계 | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| 볼트 전원 공급 장치 | Hoefer | PS300B |
참고문헌
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic u....
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