פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרו-רנ"א (miRNA) התגלו כמווסתים תאיים חשובים (מדכאי גידולים, גורמים פרו-אונקוגניים) של סרטן וגרורות. רוב המחקרים שפורסמו מתמקדים ב-miRNA יחיד כאשר הם מאפיינים את תפקידם של רנ"א קטנים בסרטן. עם זאת, כ-30% מגני ה-miRNA האנושיים מאורגנים ביחידות מקובצות שלעתים קרובות מבוטאות במשותף, מה שמצביע על מערכת מורכבת ומתואמת של ויסות RNA שאינו מקודד. נדרשת הערכה ברורה יותר של האופן שבו רשתות miRNA מקובצות מתפקדות בשיתוף פעולה כדי לווסת את צמיחת הגידול, האגרסיביות של הסרטן והעמידות לתרופות לפני תרגום רנ"א קטנים שאינם מקודדים למרפאה.
השימוש בהליך עריכת גנים קצר (CRISPR) בתיווך קרינה בתפוקה גבוהה נעשה כדי לחקור את התפקיד האונקוגני של אשכול גנומי של שבעה גנים miRNA הממוקמים בתוך לוקוס המשתרע על פני כ-35,000 bp באורך של כ-35,000 bp בהקשר של סרטן הערמונית. לצורך גישה זו, קווי תאים סרטניים אנושיים היו נגועים בווקטור לנטי-וירוס עבור דוקסיציקלין (DOX) - נוקלאז Cas9 הניתן להשראה שגדל במדיום המכיל DOX במשך 48 שעות. לאחר מכן התאים עברו טרנספקטציה משותפת עם רנ"א (tracrRNA) סינתטי המפעיל טרנס-רן (tracrRNA) המורכב עם אוליגונוקלאוטידים של CRISPR RNA (crRNA) ספציפיים לאתר גנומי, כדי לאפשר יצירה מהירה של קווי תאים סרטניים הנושאים את כל מחיקת אשכול ה-miRNA ומחיקות של צבירי גנים בודדים או משולבים של miRNA בניסוי יחיד.
היתרונות של מערכת עריכת גנים בתפוקה גבוהה זו הם היכולת להימנע מתת-תקצוב וקטור DNA גוזל זמן רב, הגמישות בהעברת תאים עם שילובי RNA מנחים ייחודיים בפורמט של 24 בארות, וגנוטיפ PCR בעלות נמוכה יותר באמצעות ליזטים של תאים גולמיים. מחקרים המשתמשים בגישה יעילה זו מבטיחים לחשוף יתירות תפקודית ואינטראקציות סינרגטיות/אנטגוניסטיות בין חברי אשכול miRNA, אשר יסייעו באפיון רשתות הרנ"א הקטנות המורכבות שאינן מקודדות המעורבות במחלות אנושיות ויודיעו טוב יותר על תכנון טיפולי עתידי.
מבוא
נדרשים כלי מחקר טובים יותר כדי לחקור את התרומה של רנ"א שאינם מקודדים במחלות אנושיות. דיסרגולציה של MiRNA נצפית לעתים קרובות בהפרעות אנושיות כגון סרטן כאשר משווים את פרופילי הביטוי של רנ"א קטנים אלה שאינם מקודדים ברקמות ובנוזלי הגוף (למשל, דם, שתן) של חולי סרטן לעומת אנשים שאינם סרטניים ובריאים, שימוש במיקרו-מערכים, שימוש במיקרו-מערכים, PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR), וטכנולוגיות ריצוף עמוק מהדור הבא 1,2 . עבודות אחרונות אפיינו תת-קבוצה גדולה של miRNA אלה כגורמים מדכאי גידול, אונקוגניים וגרורות השולטים על היווצרות הגידול, התקדמות המחלה ועמידות לתרופות. ביטוי יתר ניסיוני ו/או הפחתה/אובדן של miRNAs גורמים להשלכות ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה לעריכת גנים של CRISPR ותכנון RNA מנחה ליצירת קווי תאים נוקאאוטים של צבירי miRNA
- צור קובץ דנ"א המכיל את הרצף הגנומי המלא של אזור העניין של צביר miRNA (אינטרגני, אינטרוני) ולפחות 1 kB של אזורים גנומיים מסביב באמצעות תוכנת ביאור רצף DNA19.
- השתמש בכלי לעריכת תכונות בקובץ הדנ"א שנוצר כדי לסמן את לוקוס צביר miRNA ממוקד (אינטרגני, אינטרוני) ואת כל רצף סיכות השיער של miRNA השייך לאשכול ה-miRNA, וכן לציין גנים אחרים של קידוד וקידוד ו/או תכונות רגולטוריות סמוכות אחרות 5,20,21,22.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול מחיקת קריספר בתפוקה גבוהה זה הופעל בהצלחה באמצעות טרנספקציה של קווי תאי סרטן אנושיים מסוג LNCaP ו-PC3-ML הניתנים להשראה של Cas9 עם רנ"א מנחי אוליגונוקלאוטידים סינתטיים המכוונים לאשכול miR-888, שנחקרו בהקשר של סרטן הערמונית. אשכול miR-888 זוהה בתחילה בבדיקת פרופיל ביטוי כגבוהה בחולי סרטן הערמונית עם מחלה בדרגה גבוהה בהשוואה לחולים בדרגה נמוכה ולא סרטניים 9,10. אשכול miR-888, המשתרע על פני 35,124 bp, מורכב משבעה miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הליך עריכת גנים זה של קריספר מאפשר לחוקר ליצור במהירות פאנל שלם של קווי תאים הנושאים שילובים ייחודיים של מחיקת אשכולות miRNA. הטרנספקציה של רנ"א מנחים סינתטיים המורכבים מ-crRNA גנומיים ספציפיים לאתר 5' ו-3' המחושלים ב-tracrRNA סינתטי (יחס טוחנות של 1:1) בפרוטוקול זה מונעת תת-קלונינג של וקטור פלסמיד הגוזל זמן רב יותר ומאפשרת תכנון ניסיוני גמיש יותר ובעל תפוקה גבוהה יותר באמצעות פורמט של 24 בארות. יצירת קווי התאים הנושאים קלטת Cas9 lentiviral הניתנת להשראה על ידי DOX מאפשרת ביטוי Cas9 מווסת היטב וחזק ב-DOX במהלך טרנספקציה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
קווי תאים PC3-ML סופקו בחביבות על ידי מארק סטרן (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל). ג'סטין טוקסי סייע בגנוטיפ PCR. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן ברידן אדמס, קרן מחקר תרגומית של ריאן, ומענק של מועצת המחקר לבריאות של חבר העמים הבריטי (CHRB-274-11-20) ל- AE-K.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 מ"ל צינורות PCR, כובע שטוח | פישר | 14-230-225 | כלי פלסטיק |
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | Seal-Rite | 1615-5500 | כלי פלסטיק |
| 24 בארות צלחת תרבית רקמות | קורנינג Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | מגיב PCR, גנוטיפ |
| צלחת תרבית רקמות 6 בארות | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96 בארות צלחת תרבית רקמות | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 נוגדן [7A9-3A3], עכבר חד שבטי | AbCam | ab191468 | מגיב כתם מערבי; 160 kDa; דילול 1:200 |
| אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100x) | מגיב תרבית Gibco | 15240062 | Tisuue |
| מנוע חיפוש נוקלאוטידים של המרכז | הלאומי למידע ביוטכנולוגי | NA | Freeware; אתר אינטרנט: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, הידרוכלוריד, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | מגיב CRISPR; כימיקלים, מלאי עבודה = 1 מ"ג/מ"ל במים |
| Countess 3 מונה תאים אוטומטי | Invitrogen | A50298 | ציוד; מונה תאים |
| צינורות קריוגניים | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA Freeware; אתר אינטרנט: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer | |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | מגיב טרנספקציה T-2002-02 | ; קווי תאים LNCaP ו-PC3-ML |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | פישר | BP231100 | מגיב תרבית Tisuue |
| DMEM בינוני עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט | קורנינג | MT10013CV | מגיב תרבית Tisuue; מדיה לתאי PC3-ML |
| דוקסיציקלין הידרוכלוריד, תמיסה מוכנה | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | מגיב CRISPR; כימיקלים, מלאי עבודה = מלאי 1 מ"ג/מ"ל במים |
| DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום | מגיב תרבית Gibco | 14190144 | Tisuue |
| Edit-R CRISPR-Cas9 tracrRNA סינתטי, 20 ננומול, מעוצב | Dharmacon, Inc. | מגיב U-002005-20 | CRISPR; tracrRNA אוניברסלי oligonucleotides |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, מומלח/מוגן, 2 ננומול | Dharmacon, Inc. | מגיב קריספר crRNA-460XXX; | אוליגונוקלאוטידים crRNA מעוצב |
| EditR השראת לנטי-ויראלי hEF1aBlastCas9 חלקיקי נוקלאז, 50 μ L, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | מגיב CRISPR; לנטי-iCas9; סטרפטוקוקוס פיוגנס Cas9 השראת דוקסיציקלין מערכת וקטור |
| אנסמבל Ensembl | NA | Freeware; אתר אינטרנט: [ensembl.org] שימוש: דפדפן גנום לזיהוי seuqnces נוקלאוטידים המכילים את אשכול ה-miRNA ורצפי הגנים/רגולציה שמסביב. | |
| נוגדן GAPDH (FL-335), מגיב רב-שבטי של ארנב | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western Blot Reagent; 37 kDa; דילול 1:500 |
| ג'ל/PCR ערכת מיצוי שברי DNA | IBI Scientific | IB47010 | מגיב אלקטרופורזה ג'ל חומצת גרעין |
| סרום בקר עוברי Gibco, | מגיב תרבית Gibco 16000044 Tisuue | ||
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | מגיב H9268 | CRISPR; כימיקלים, מלאי עבודה = 0.8 מ"ג/מ"ל |
| Immobilon-FL PVDF ממברנה | MilliporeSigma | IPFL10100 | מגיב כתם מערבי; יירוט ניטרוצלולוזה |
| (TBS) מאגר חוסם | LI-COR | 927-60001 | מגיב כתם מערבי |
| IRDye 680RD עז נגד עכבר IgG נוגדן משני | LI-COR | 926-68070 | מגיב כתם מערבי |
| IRDye 800CW עז נגד ארנב IgG נוגדן משני | LI-COR | 926-32211 | מגיב כתם מערבי |
| מיקרוצנטריפוגה | אפנדורף | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; אתר אינטרנט: [mirbase.org] שימוש: Borowser מפרט את כל סיכות השיער miRNA המבוארות, רצפי miRNA בוגרים ומיפוי miRNA מקובץ קשור בטווח של 10 kb. |
| NuPAGE 4 עד 12%, ביס-טריס, 1.0 מ"מ, מיני ג'ל חלבון, 10 בארות | Invitrogen | NP0321BOX | Western Blot Reagent |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | ציוד; הדמיית כתם מערבי |
| Opti-MEM סרום מופחת מדיום | Gibco | 31985062 | מגיב טרנספקציה |
| ינשוף D2 מערכת אלקטרופורזה רחבת ג'ל | ינשוף | D2-BP | ציוד; מערכת אלקטרופורזה של ג'ל חומצות גרעין |
| PCR פריימרים, מתוכננים (אוליגונוקלאוטידים של DNA חד-גדיליים) | משולב | NA | PCR, גנוטיפ |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase (2 U/µ L) | Thermo Scientific | F530S | , גנוטיפ |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot Reagent |
| Proteinase K Solution (20 מ"ג/מ"ל), | Invitrogen | 25530049 | , גנוטיפ |
| RNase A, DNase וללא פרוטאז (10 מ"ג/מ"ל)Thermo | Scientific | EN0531 | מגיב PCR, גנוטיפ |
| RPMI 1640 בינוני | גיבקו | MT10041CV | מגיב תרבות Tisuue; מדיה עבור תאי LNCaP |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA Freeware; אתר אינטרנט: [snapgene.com] שימוש: תוכנת הערת רצף DNA ליצירת קובץ DNA לעיצוב gRNA ואיזה מדגיש את מיקום אשכול ה-miRNA (אינטרוני, אינטרוני), כל רצף סיכות ראש miRNA בודד השייך לאשכול ה-miRNA, וגנים מקודדים ולא מקודדים ו/או תכונות רגולטוריות סמוכות אחרות | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), ללא פנול אדום | Gibco | 12563029 | מגיב תרבית Tisuue; טריפסין רקומביננטי |
| UltraPure | Agarose Invitrogen | 16500100 | מגיב ג'ל אלקטרופורזה של חומצת גרעין |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipment |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | ציוד; מערכת אלקטרופורזה של ג'ל חלבון |
מקורות
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
