نحن نصف نظام تصوير قابل للتكرار ومؤتمت وغير متحيز لتوصيف وظيفة الوصلة العصبية العضلية باستخدام الأنسجة العضلية الهيكلية البشرية المهندسة والخلايا العصبية الضوئية الوراثية. يسمح هذا النظام بالقياس الكمي الوظيفي للاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت ويكتشف تناقص الوظيفة العصبية العضلية الناجمة عن السموم العصبية والوهن العضلي الوبيل مصل المريض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هندسة وتوصيف نموذج بصري وراثي للوصلة العصبية العضلية البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ترتبط العديد من الأمراض العصبية العضلية ، مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) ، بخلل وظيفي في الوصلة العصبية العضلية (NMJ) ، والتي يصعب توصيفها في النماذج الحيوانية بسبب الاختلافات الفسيولوجية بين الحيوانات والبشر. توفر هندسة الأنسجة فرصا لتوفير نماذج في المختبر من NMJs البشرية الوظيفية التي يمكن استخدامها لتشخيص والتحقيق في أمراض NMJ واختبار العلاجات المحتملة. من خلال دمج البروتينات البصرية الجينية في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، قمنا بتوليد الخلايا العصبية التي يمكن تحفيزها بأطوال موجية محددة من الضوء. إذا كان NMJ صحيا ووظيفيا ، فإن الإشارة الكيميائية العصبية من motoneuron تؤدي إلى تقلص العضلات. من خلال دمج علم البصريات الوراثي والتصنيع الدقيق مع هندسة الأنسجة ، أنشأنا منهجية غير متحيزة وآلية لتوصيف وظيفة NMJ باستخدام تحليل الفيديو. تم تطوير بروتوكول موحد لتشكيل NMJ ، والتحفيز البصري مع تسجيل الفيديو في وقت واحد ، وتحليل الفيديو لانقباض الأنسجة. تحفيز الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية عن طريق الضوء للحث على تقلصات العضلات الهيكلية يلخص فسيولوجيا NMJ البشرية ويسمح بالقياسات الوظيفية المتكررة ل NMJ بمرور الوقت واستجابة للمدخلات المختلفة. نحن نظهر قدرة هذه المنصة على إظهار التحسينات الوظيفية في الاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت وتوصيف الآثار الضارة للأجسام المضادة MG للمريض أو السموم العصبية على وظيفة NMJ.
المقدمة
التقاطع العصبي العضلي (NMJ) هو المشبك الكيميائي بين الخلايا العصبية المتحركة (MNs) وخلايا العضلات الهيكلية (SkM) التي تسمح بتقلص العضلات. السموم ، مثل السموم العصبية α بونغاروتوكسين (BTX) ، أو الأمراض العصبية العضلية (NMD) مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) يمكن أن تؤدي إلى انحطاط NMJ وانخفاض في السيطرة على العضلات1. تلخص نماذج الأنسجة البشرية المهندسة بيولوجيا بشكل أفضل الآليات الوظيفية والفسيولوجية ل NMJs البشرية وتوفر إمكانات انتقالية أكبر من النماذج الحيوانية.
في حين أن النماذج الحيوانية قد تقدمت في فهم تكوين ووظيفة NMJ ، هناك اختلافات كبيرة بين نقاط الاشتباك العصبي البشرية والحيوانية التي تحد من ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إنشاء جميع خطوط الخلايا لهذا العمل واستخدامها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعة كولومبيا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.
1. إعداد المفاعل الحيوي
- جعل قوالب المفاعلات الحيوية
- قم بتنزيل ملف CAD الخاص بالمفاعل الحيوي من ملف CAD التكميلي أو قم بإنشاء تصميم خاص مخصص.
- إنشاء مسار أدوات CNC من نموذج 3D باستخدام برنامج CAM.
- آلة قوالب الأسيتال باستخدام آلة طحن CNC.
- تصنيع المفاعلات الحيوية
- امزج قاعدة 10: 1 إلى خليط عامل المعالجة من polydimethylsiloxane (PDMS ، 77 جم من الخليط لكل 4 منصات / قوالب).
- ضع الخليط في غرفة فراغ ، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إنشاء التقاطعات العصبية العضلية عن طريق المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الضوئية المشتقة من hiPSC مع أنسجة العضلات الهيكلية غير البصرية الوراثية. تم زرع الخلايا العضلية الهيكلية الأولية البشرية (SkM) في المنصات وتمييزها إلى أنابيب عضلية متعددة النوى باستخدام بروتوكول 2 أسبوع. تم تمييز الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية بشكل منفصل ، ولكن بالتوازي مع تمايز الأنبوب العضلي ، ثم زرعت في المنصة (الشكل 1). بدأت الأنسجة في الانكماش استجابة لتحفيز الضوء الأزرق بعد 7-12 يوما من بذر MN ، مما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا النظام هو نموذج الأنسجة البشرية 3D هندسيا الذي يجمع بين علم البصريات ومعالجة الفيديو لتمكين التقييم الآلي وغير المتحيز لوظيفة NMJ. باستخدام بروتوكول موحد ، أثبتنا القدرة على قياس التغيرات في وظيفة NMJ أثناء التطور الفسيولوجي وتوصيف الآثار الضارة للأمراض مثل التعرض للسموم العصبية والوهن العضلي الوبيل مصل المريض.
وقد أفادت دراسات سابقة عن القدرة على نمذجة MG مع الخلايا العصبية المتحركة المشتقة من hPSC البصرية في الزراعة المشتركة مع الأنابيب العضلية الهيكلية باستخدام مصل مريض MG
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نحن نقدر بامتنان الدعم التمويلي المقدم من المعاهد الوطنية للصحة [أرقام المنح EB025765 و EB027062] ، ووزارة الدفاع [رقم الجائزة W81XWH-18-1-0095] ، و UCSF Health Innovation via Engineering (زمالة فيروس نقص المناعة البشرية). نحن نقدر بامتنان مركز الخلايا الجذعية بجامعة كولومبيا لمساعدته وتوجيهه في إعادة برمجة الخلايا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > خلايا < / قوي > SkMDC | |||
| كوك ميوسايت | P01059-14M | ||
| <قوي > الوسائط والمكملات الغذائية < / قوي > | |||
| متقدم DMEM / F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| محلول ألبومين مصل البقر | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| مكمل G-5 (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| المضاد الحيوي الانتقائي الجيني (كبريتات G418) (50 مجم / مل) ThermoFisher | Scientific | 10131-035 | |
| الأنسولين ، المؤتلف البشري | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | تقنيات الخلايا الجذعية | 100-0276 | |
| طقم وسائط النمو MyoTonic | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 مكمل | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NbActiv4 500 مل | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal متوسط | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A متوسط | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | تقنيات الخلايا الجذعية | 5872 | |
| Plasticware< / Strong> | |||
| 30 mm نظام مكعب قفص | ThorLabs | CM1-DCH و CP33 و ER1-P4 و ER2-P4 | |
| 37 & micro; م مصفاة قابلة للانعكاس ، | تقنيات الخلايا الجذعية | 27250 | |
| 546 نانومتر مرشح الإثارة قصير التمرير | Semrock | FF01-546 / SP-25 | |
| 573 نانومتر مرآة ثنائية اللون | Semrock | FF573-Di01 &ndash ؛ 25x36 | |
| 594 نانومتر مرشح انبعاث طويل | التمرير Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 نانومتر مرشح إثارة طويل | التمرير Semrock | BLP01-594R-25 | |
| أزرق (470 نانومتر) Rebel LED على SinkPAD-II قاعدة مربعة 10 مم - 65 لومن @ 700 مللي أمبير | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8 درجة ؛ بلوري 10 مم شعاع دائري بصري - أرجل متكاملة | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 مم طبق ثقافة مرفق منخفض للغاية | Corning | 3261 | |
| بالوعة الحرارة | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| <قوي>البصريات< قوية> | |||
| PLURIStrainer 400 & م ، 25 عبوة ، معقمة | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 & micro ؛ م ، 25 عبوة ، معقمة | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| أحمر (627 نانومتر) Rebel LED على قاعدة مربعة SinkPAD-II 10 مم - 65 لومن @ 700 مللي أمبير | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| غشاء قزحية تعمل بحلقة | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED | سائقين ThorLabs | LEDD1B ، KPS101 | |
| < قوي >قوالب < قوي> | |||
| أنثى الخيوط عرافة المواجهات , 3 1/2 "10-32 ، مترابطة جزئيا 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile ؛ C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| عوامل النمو< / قوي> | |||
| الأدينوزين 3 & prime;,5&-أحادي الفوسفات الدوري | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 ملغ | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 ملغ | R & D Systems | 2634/10 | |
| CNTF البشري ، درجة البحث ، 5 & ز | ميلتينيل بيوتيك | 130-096-336 | |
| بروتين فيترونكتين بشري ، CF | R & D Systems | 2349-VN-100 | |
| بروتين فيترونكتين البشري ، CF | R & D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 بروتين بشري مؤتلف | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| بروتين الفأر Laminin ، | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| المؤتلف البشري Agrin Protein | R & D Systems | 6624-AG-050 | |
| بروتين GDNF البشري المؤتلف ، CF 50ug | R & D Systems | 212-GD-050 / CF | |
| العصبية البشرية المؤتلفة 3 & nbsp ؛ 100 أوغرام | علوم الخلية | CRN500D | |
| الخلايا | العصبية البشرية المؤتلفة 4 | CRN501B | |
| القنفذ الصوتي البشري المؤتلف / Shh (C24II) N-Terminus | R & D Systems | 1845-SH-100 | |
| المؤتلف للإنسان / المورين / الفئران BDNF 50 ميكروغرام | Peprotech | 450-02 | |
| حمض الريتينويك ، 50 مجم | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG ناهض ناعم | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 مجم | تقنيات الخلايا الجذعية | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| فيترونكتين من البلازما البشرية | ميليبور سيجما | V8379-50UG | |
| Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد | توكرس | 1254 | |
| <قوي >أجسام مضادة< / قوي > | |||
| ألفا الأكتينين mAb (الماوس IgG1) | أبكام | ab9465 | |
| الكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT) (الماعز) | ميليبور | AB144P | |
| Desmin mAb (ماوس IgG1) | سلسلة الميوسين | الثقيلة Dako M076029-2 | |
| (MHC) (الماوس IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| المرحلة الآلية | الأجهزة العلمية التطبيقية | MS- 2000 XYZ | |
| منظف البلازما الموسع | Harrick Plasma | PDC-001 ( 115 فولت) | |
| Invitrogen Countess الآلي عداد الخلايا | المارشال العلمي | I-CACC | |
| IX-81 مجهر مضان مقلوب | أوليمبوس | IX-ILL100LH | |
| سلسلة نظام حاضنة المرحلة | العلوي Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS كاميرا | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software< / قوي> | |||
| برنامج اردوينو (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam ل Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| عناصر NIS | نيكون | البحوث | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
المراجع
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
