이 프로토콜은 마우스 뇌의 자유 부유 조직 절편을 절편화, 염색 및 이미징하는 방법을 설명하고, 이어서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 영역 중첩 또는 타일링의 분석에 대한 상세한 설명을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
성상세포는 뇌 내의 거의 모든 유형의 세포 및 구조와 상호 작용할 수있게 해주는 놀라운 수준의 형태 학적 복잡성을 가지고 있습니다. 이러한 상호 작용을 통해 성상 세포는 시냅스 형성, 신경 전달 및 이온 항상성을 포함한 많은 중요한 뇌 기능을 적극적으로 조절합니다. 설치류 뇌에서 성상 세포는 출생 후 처음 세 주 동안 크기와 복잡성이 증가하고 뇌를 타일링하기 위해 뚜렷하고 겹치지 않는 영역을 확립합니다. 이 프로토콜은 마우스 뇌에서 자유 부유 조직 절편을 사용하여 성상 세포 영역 부피 및 성상 세포 타일링을 분석하기위한 확립 된 방법을 제공합니다. 먼저, 이 프로토콜은 자유 부유 조직 절편의 조직 수집, 냉동 절제술 및 면역염색을 위한 단계를 기술한다. 둘째,이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 성상 세포 영토 부피 및 영토 중첩 부피의 이미지 획득 및 분석을 설명합니다. 마지막으로,이 원고는 이러한 방법의 장점, 중요한 고려 사항, 일반적인 함정 및 한계에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 형광 표지를 가진 뇌 조직을 필요로 하며, 일반적인 실험실 장비, 공초점 현미경 및 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 사용하도록 설계되었다.
서론
성상세포는 뇌에서 많은 중요한 기능을 수행하는 정교하게 분지된 세포이다1. 마우스 피질에서, 방사상 신경교세포 줄기 세포는 후기 배아 및 초기 산후 단계2 동안 성상세포를 발생시킨다. 출생 후 처음 세 주 동안, 성상세포는 크기와 복잡성이 증가하여 시냅스와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지를 개발합니다1. 동시에, 성상세포는 이웃하는 성상세포와 상호작용하여 갭 접합 채널(4)을 통한 통신을 유지하면서 뇌(3)를 타일링하기 위해 이산적이고 겹치지 않는 영역을 구축한다. 성상세포 형태학 및 조직은 모욕 또는 상해5 후 많은 질병 상태에서 붕괴되며, 이는 적절한 뇌 기능을 위한 이러한 과정의 중요성을 나타낸다. 정상적인 발달, 노화 및 질병 동안 성상 세포 형태 학적 특성을 분석하면 성상 세포 생물학 및 생리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 유전자 조작에 따른 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 형태학적 복잡성의 확립 및 유지를 지배하는 세포 및 분자 메커니즘을 식별하기 위한 귀중한 도구이다.
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프로토콜
모든 마우스는 채플 힐의 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 비교 의학 부문 (IACUC 프로토콜 번호 21-116.0)에 따라 사용되었습니다. 출생 후 21일째에 남녀 모두의 마우스(P21)를 이들 실험에 사용하였다. CD1 마우스는 상업적으로 수득되었고(표 물질), MADM9 WT:WT 및 MADM9 WT:KO 마우스는 앞서9에 기술하였다.
참고 :이 프로토콜은 성상 세포의 희소 한 집단에서 형광 단백질 발현을 가진 뇌를 필요로합니다. 형광 단백질 발현은 유전적으로 또는 바이러스적으로, 또는 전기천공에 의해 도입될 수 있다. 성상세포를 희소하게 표지하는 방법의 세부사항은 이전에 발표된 연구 및 프로토콜 1,7,8,9,10,11,12,13에 기술되어 있다.
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결과
그림 1에서는 이 프로토콜의 주요 단계 및 워크플로에 대한 개략적인 개요를 보여 줍니다. 그림 2는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 표면을 생성하고, 표면에 가까운 반점을 생성하고, 볼록한 선체를 생성하는 주요 단계의 스크린샷을 보여줍니다. 그림 3은 성상세포 영역 중첩/타일링을 결정하기 위해 이 기술의 적용을 보여줍니다. 도 4에서, 이전에 출판된 원고(9 )로부터의 대표적인 결과는 이 프로토콜의 적용을 입증한다. 도 4A 및 도 4B에서, 성상세포-풍부 세포 부착 분자 간CAM의 녹다운은 성상세포 영역 부피를 상당히 감소시킨다. 도
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토론
이 프로토콜은 마우스 피질에서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 타일링을 분석하기 위한 확립된 방법을 설명하며, 관류로 시작하여 이미지 분석으로 끝나는 모든 주요 단계를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 집단에서 형광 단백질을 발현하는 마우스의 뇌를 필요로 한다. 이 요구 사항 외에, 임의의 연령의 마우스가 이 프로토콜에 사용될 수 있으며, 관류 설정에 대한 약간의 조정과 매립 금형에 추가된 동결 매체의 부피만 있을 뿐이다. 뇌 조직 섹션 7,11에서 성상세포 분지화 복잡성 및 부피의 분석을 위해 다른 방법들이 발표되었지만, 이 프로토콜은 몇 가지 독특한 장점을 갖는다. 첫째, 이 프로토콜은 성상세포 영역 부피를 획득하는데 사용될 수 있는 커스텀 코드를 기술한다. 성상세포 영토 부피는 분지화 복잡성에 관계없이 성상세포가 차지하는 전체 공간을 측정한다는 점에서 성상세포 세포 부피와 구별되는 측정치이.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
현미경 검사는 UNC 신경 과학 현미경 코어 (RRID : SCR_019060)에서 수행되었으며, NIH-NINDS 신경 과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54 HD079124의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다. 그림 4의 이미지와 데이터는 출판사의 허가를 받아 이전 간행물(9 )에서 재인쇄된다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #5 겸자 | Roboz | RS-5045 | |
| 1mL TB 주사기 | Becton Dickinson(BD) | 309623 | |
| 10x TBS(트리스 완충 식염수) | 30g Tris, 80g NaCl, 2g KCl, HCl에서 pH 7.4, dH2O에서 1L, 실온(RT)에서 보관12 | ||
| 웰 플레이트 | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100mL 10x TBS + 900mL dH2O; RT | ||
| 1x TBS + 헤파린 | 28.2 mg 헤파린 + 250 mL 1x TBS에 저장; 4 °에 저장; C | ||
| 24웰 플레이트 | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% 자당 TBS | 15g 자당, 1x TBS - 50mL;4°C에 보관; | ||
| 의 C 4 % PFA (파라 포름 알데히드) | 40g PFA, 4-6 NaOH 펠릿, 100 mL 10x TBS, dH2< / sub>O에서 1 L;4 °C에 저장; C | ||
| Avertin | 0.3125g 트리 브로 모에 탄올, 0.625 mL 메틸 부탄올, dH2< / sub>O to 25 mL; 4 °C에서 보관; C; | ||
| 막기 그리고 항체 완충기 | ; 4 °에 저장하십시오; C | ||
| CD1 마우스 | Charles River | 022 | |
| 뇌용 수집 바이알 | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| 컨포칼 수집 소프트웨어 | Olympus | FV31S-SW | |
| 컨포칼 현미경 | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| 저온 유지 장치 블레이드 | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| 냉동 매체 | 2:1 30% 자당:OCT; RT | ||
| GFP 항체 | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol에 보관 | Thermo Scientific | 158920010 | |
| 염소 안티 닭 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| 염소 안티 토끼 594 | Invitrogen | A11037 | |
| 염소 혈청 | Gibco | 16210064 | |
| 헤파린 | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| 염산 | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | 버전 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| 금속 도시락 깡통 | 병자리 | N/A | 아마존에서, "DIY 대형 재미 상자" |
| 메틸부탄올 | 시그마-알드리치 | 152463 | |
| 마이크로 해부 가위 | Roboz | RS-5921 | |
| 장착 매체 | 20mM 트리스 pH 8.0, 90% 글리세롤, 0.5% N-프로필 갈레이트; 4 °에 저장; C; 최대 2개월 동안 사용 | ||
| 가능 매니큐어 | VWR | 100491-940 | |
| N-프로필 갈레이트 | 시그마-알드리치 | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| 오일 | Olympus | IMMOIL-F30CC | 현미경/대물 |
| 전용 운영 가위 6" | Roboz | RS-6820 | |
| 궤도 플랫폼 쉐이커 | Fisher Scientific | 88861043 | 필요한 최소 속도: 25 rpm |
| 페인트브러시 | Bogrinuo | N/A | 아마존에서, "디테일 페인트 브러시 - 미니어처 브러시 " |
| 파라 포름 알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 파스퇴르 피펫 (5.75 ") | VWR | 14672-608 | |
| 파스퇴르 피펫 (9 ") | VWR | 14672-380 | |
| 염화칼 | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| 면도날 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP 항체 | Rockland | 600-401-379 | |
| 절제 매체 | 1:1 글리세롤:1x TBS; RT Slides에 보관 | ||
| VWR | 48311-703 | ||
| 소듐 chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 수산화나트륨 | 시그마-알드리치 | S5881 | |
| 자당 | 시그마-알드리치 | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 ( 고품질) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | 해당 없음 | N/A | 맞춤형 XTension은 보조 자료로 제공합니다 |
참고문헌
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
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