هنا ، نقدم بروتوكولا لإعادة تشكيل حزم الأنابيب الدقيقة في المختبر وتحديد القوى التي تمارس داخلها مباشرة باستخدام الاصطياد البصري المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. يسمح هذا الفحص بقياس القوى والإزاحات الناتجة عن مجموعات البروتين داخل شبكات الأنابيب الدقيقة النشطة على مستوى النانو.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس القوى مباشرة داخل حزم الأنابيب الدقيقة النشطة المعاد تشكيلها
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تستخدم شبكات الأنابيب الدقيقة في الخلايا لإنجاز مجموعة واسعة من المهام ، بدءا من العمل كمسارات لنقل الحويصلة إلى العمل كمصفوفات متخصصة أثناء الانقسام الفتيلي لتنظيم فصل الكروموسومات. تشمل البروتينات التي تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة محركات مثل الكينيسين والداينين ، والتي يمكن أن تولد قوى نشطة وحركة اتجاهية ، بالإضافة إلى البروتينات غير الحركية التي تربط الخيوط في شبكات أعلى مرتبة أو تنظم ديناميكيات الخيوط. حتى الآن ، ركزت الدراسات الفيزيائية الحيوية للبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة بشكل كبير على دور البروتينات الحركية المفردة اللازمة لنقل الحويصلة ، وتم إحراز تقدم كبير في توضيح خصائص توليد القوة والتنظيم الكيميائي الميكانيكي للكينيسين والداينين. ومع ذلك ، بالنسبة للعمليات التي تعمل فيها الأنابيب الدقيقة كشحنة ومسار ، كما هو الحال أثناء انزلاق الفتيل داخل المغزل الانقسامي ، لا يفهم الكثير عن التنظيم الفيزيائي الحيوي لمجموعات البروتينات المتشابكة المعنية. هنا ، نقوم بتفصيل منهجيتنا للتحقيق المباشر في توليد القوة والاستجابة لها داخل شبكات الحد الأدنى من الأنابيب الدقيقة المتشابكة المعاد تشكيلها من الأنابيب الدقيقة المنقاة والبروتينات الانقسامية. يتم ربط أزواج الأنابيب الدقيقة بواسطة البروتينات ذات الأهمية ، ويتم تثبيت أحد الأنابيب الدقيقة إلى غطاء المجهر ، ويتم التلاعب بالأنبوب الدقيق الثاني بواسطة مصيدة بصرية. يسمح الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي المتزامن بتصور متعدد القنوات لجميع مكونات شبكة الأنابيب الدقيقة هذه حيث تنزلق الخيوط بعيدا لتوليد القوة. نوضح أيضا كيف يمكن استخدام هذه التقنيات لاستكشاف قوى الدفع التي تمارسها مجموعات kinesin-5 وكيف تنشأ قوى الكبح اللزجة بين أزواج الأنابيب الدقيقة المنزلقة المتشابكة بواسطة MAP PRC1 الانقسامي. توفر هذه المقايسات نظرة ثاقبة لآليات تجميع المغزل ووظيفته ويمكن تكييفها على نطاق أوسع لدراسة ميكانيكا شبكة الأنابيب الدقيقة الكثيفة في سياقات متنوعة ، مثل المحور العصبي والتشعبات للخلايا العصبية والخلايا الظهارية القطبية.
المقدمة
تستخدم الخلايا شبكات الأنابيب الدقيقة لأداء مجموعة متنوعة من المهام الميكانيكية ، بدءا من نقل الحويصلة1،2،3 إلى فصل الكروموسومات أثناء الانقسامالفتيلي 4،5،6. العديد من البروتينات التي تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة ، مثل البروتينات الحركية الجزيئية kinesin و dynein ، تولد قوى وتنظمها الأحمال الميكانيكية. لفهم كيفية عمل هذه الجزيئات الحرجة بشكل أفضل ، استخدم الباحثون طرقا فيزيائية حيوية أحادية الجزيء ، مثل الاصطياد البصري والفحص المجهري TIRF ، لمراقبة المعلمات الحرجة بشكل مباشر مثل معدلات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الأنابيب الدقيقة
ملاحظة: عند استخدام بروتينات متشابكة تحمل علامة GFP ، أحمر (على سبيل المثال ، رودامين) وأحمر بعيد (على سبيل المثال ، HiLyte647 البيوتينيل ، يشار إليه باسم البيوتينيل الأحمر البعيد في بقية النص) يعمل وضع العلامات الفلورية العضوية للأنابيب الدقيقة بشكل جيد. يمكن تحقيق الحد الأدنى من الحديث المتبادل بين القنوات الثلاث أثناء التصوير باستخدام مرشح مضان الانعكاس الداخلي الكلي رباعي النطاق عالي الجودة (TIRF).
- تحضير مخزون بذور الأنابيب الدقيقة GMPCPP
- قم بتعليق 1 ملغ من التوبولين المجفف بالتجميد غير المسمى في 84 ميكرولتر من الثلج البارد 1x BRB80 (80 مللي متر أنابيب ، 1 مللي متر MgCl2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يعتبر إعداد حزم الأنابيب الدقيقة المناسبة للتحليل الفيزيائي الحيوي ناجحا إذا تم استيفاء العديد من المعايير الرئيسية. أولا ، يجب أن يكشف التصوير بثلاثة ألوان عن اثنين من الأنابيب الدقيقة المحاذاة مع تركيز البروتين المتشابك الذي يزين منطقة التداخل بشكل تفضيلي (الشكل 5B و C والشكل 6B). من الناحية المثالية ، يجب أن تكون المسافة بين حافة التداخل والطرف الحر للأنبوب الدقيق الرودامين 5 ميكرومتر على الأقل لتوفير مساحة مادية كافية بين ح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم استخدام شبكات الأنابيب الدقيقة من قبل أنواع لا تعد ولا تحصى من الخلايا لإنجاز مجموعة واسعة من المهام ذات الطبيعة الميكانيكية بشكل أساسي. من أجل وصف كيفية عمل الخلايا في كل من الحالات الصحية والمرضية ، من الأهمية بمكان فهم كيفية تنظيم هذه الشبكات ذات النطاق الميكروني وتنظيمها بواسطة البروتينات بحجم النانومتر التي تبنيها بشكل جماعي. الأدوات الفيزيائية الحيوية مثل الملقط البصري مناسبة تماما لفحص الكيمياء الميكانيكية للبروتينات الرئيسية على هذا النطاق. انعكاسا لتنوع وظيفة شبكة الأنابيب الدقيقة ، تم استكشاف الأشكال الهندس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من R21 AG067436 (إلى JP و SF) ، و T32 AG057464 (إلى ET) ، وصناديق بدء تشغيل معهد رينسيلار للفنون التطبيقية (إلى SF).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ليزر ألياف الإيتربيوم 10 واط ، 1064 نانومتر | IPG الضوئيات | YLR-10-1064-LP | |
| 405/488/561 / 640nm مجموعة ليزر رباعية النطاق لتطبيقات TIRF | Chroma | TRF89901v2 | |
| 6x الجسم المضاد للعلامة ، البيوتين المترافق | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
| الأسيتون ، HPLC الصف | فيشر Scientific | 18-608-395 | |
| ألفا كازين من حليب الأبقار | سيجما | 1002484390 | |
| ATP | فيشر Scientific | BP413-25 | |
| Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
| Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio، Inc. | NC0479433 | |
| BL21 (DE3) خلايا رشيد | ميليبور سيجما | 71-400-3 | |
| كاتالاز | إم بي بيوميديكلز ذ.م.م | 190311 | |
| CFI Apo 100X / 1.49NA غمر الزيت الهدف TIRF | الهدف نيكون | N / A | |
| Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
| Coverslip Mini-Rack ، ل 8 أغطية | فيشر Scientific | C14784 | |
| المهام الحساسة | كيمبرلي كلارك | 34120 | |
| سكر العنب اللامائي | فيشر العلمي | BP3501 | |
| D-السكروز | فيشر العلمي | BP220-1 | |
| DTT | فيشر Scientific | BP172-25 | |
| ترموستات الغمر Ecoline E100 مع 003 حمام | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
| EDTA | فيشر العلمي | BP118-500 | |
| EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
| فيجي / صورة J | https://fiji.sc/ | N / A | |
| شرائح المجهر المتجمد | Corning | 12-553-10 | 75 مم × 25 مم ، بسماكة 0.9-1.1 مم |
| جلوكوز أوكسيديز | MP Biomedicals LLC | 195196 | النوع السابع ، بدون أكسجين مضاف |
| يمكن تخزين GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | لعدة أشهر عند -20 درجة ؛ C وما يصل إلى عام عند -80 درجة ؛ C |
| Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| مختبر تجفيف | بيل آرت | 999320237 | 190 مم حجم اللوحة |
| Kanamycin Sulfate | فيشر العلمي | BP906-5 | |
| KIF5A K439 (aa: 1-439) -6مختبر | جيلبرت ، RPI | N / A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
| Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | الأنسجة الخالي من النسالة |
| ، النوع B | Cargille | 16484 | |
| Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| LuNA Laser Launch (4 قنوات: 405 ، 488 ، 561 ، 640 نانومتر) | نيكون | N / A | |
| Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
| أسيتات المغنيسيوم Tetrahydrate | فيشر Scientific | BP215-500 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio، Inc. | NC0107576 | |
| نيوترافادين | إنفيتروجين | PI31000 | |
| نيكون Ti-E مجهر مقلوب | نيكون | N / A | نيكون LuN4 ليزر |
| Ni-NTA راتنج | حراري علمي | 88221 | |
| قليل النوكليوتيد - CACCTATTCTGAGTTTGCGGA GAACTTTCAAGGC | IDT | N / A | |
| Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG | IDT | N / A | |
| أنبوب بولي كربونات سميك الجدار مفتوح ، 0.2 مل ، 7 مم × 22 مم | بيكمان كولتر | 343755 | |
| Optima-TLX جهاز طرد مركزي فائق | بيكمان كولتر | 361544 | |
| باكليتاكسيل (مكافئ للتاكسول) | أنابيب ثيرمو فيشر Scientific | P3456 | |
| ACROS Organics | 172615000 | ||
| PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
| لحم الخنزير Tubulin ، تسمية البيوتين | Cytoskeleton، Inc. | T333P | |
| توبولين لحم الخنزير ، HiLyte 647 الهيكل | الخلوي الفلوري ، Inc. | TL670M | بعيدة ذات علامة |
| حمراء الخنازير Tubulin ، الهيكل | الخلوي Rhodamine ، Inc. | TL590M | |
| توبولين لحم الخنزير ، الهيكل الخلوي لبروتين التوبولين | ، وشركة | T240 | |
| أسيتات البوتاسيوم | فيشر Scientific | BP364-500 | |
| Prime 95B sCMOS الكاميرا | الضوئية | N / A | |
| رأس مستشعر كاشف رباعي | ThorLabs | PDQ80A | |
| Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
| بيكربونات الصوديوم | فيشر Scientific | S233-500 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي | فيشر Scientific | BP332-500 | |
| نظارات الغطاء المربع | Corning | 12-553-450 | 18 مم × 18 مم ، بسمك 0.13-0.17 مم |
| Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
| Superose-6 العمود | GE Healthcare | 29-0915-96 | |
| TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
| TLA-100 دوار بزاوية | ثابتة بيكمان كولتر | 343840 | |
| منظف بالموجات فوق الصوتية (Sonicator) | Vevor | JPS-08A (DD) | 304 الفولاذ المقاوم للصدأ ، تردد 40 كيلو هرتز ، 60 واط قوة |
| Vectabond APTES الحل | ناقلات مختبرات | SP-1800-7 | |
| Windex منظف الزجاج المزود بالطاقة مع الأمونيا-دي | SC جونسون | SJN695237 |
المراجع
- Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
- Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-m....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
