Непосредственное измерение сил в восстановленных активных пучках микротрубочек

Jacob Palumbo; Ellinor Tai; Scott Forth

doi:10.3791/63819

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Непосредственное измерение сил в восстановленных активных пучках микротрубочек

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63819

⸱

10 мая 2022 г.

Jacob Palumbo^*¹ , Ellinor Tai^*¹ , Scott Forth¹

¹Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол восстановления пучков микротрубочек in vitro и непосредственной количественной оценки сил, оказываемых внутри них, с помощью одновременного оптического улавливания и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Этот анализ позволяет измерять на наноуровневом уровне силы и смещения, генерируемые белковыми ансамблями в активных сетях микротрубочек.

Аннотация

Сети микротрубочек используются в клетках для выполнения широкого круга задач, начиная от действия в качестве треков для переноса пузырьков до работы в качестве специализированных массивов во время митоза для регулирования сегрегации хромосом. Белки, которые взаимодействуют с микротрубочками, включают такие двигатели, как кинезины и динеин, которые могут генерировать активные силы и направленное движение, а также немоторные белки, которые сшивают нити в сети более высокого порядка или регулируют динамику нитей. На сегодняшний день биофизические исследования белков, связанных с микротрубочками, в подавляющем большинстве случаев сосредоточены на роли одиночных моторных белков, необходимых для переноса пузырьков, и был достигнут значительный прогресс в выяснении силообразующих свойств и механохимической регуляции кинезинов и динеинов. Однако для процессов, в которых микротрубочки действуют как груз, так и как путь, например, во время скольжения нити внутри митотического веретена, гораздо меньше понимается о биофизической регуляции ансамблей вовлеченных сшивающих белков. Здесь мы подробно описываем нашу методологию непосредственного зондирования генерации силы и реакции в сшитых минимальных сетях микротрубочек, восстановленных из очищенных микротрубочек и митотических белков. Пары микротрубочек сшиваются интересующими белками, одна микротрубочка иммобилизуется в крышку микроскопа, а вторая микротрубочка управляется оптической ловушкой. Одновременная флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения позволяет осуществлять многоканальную визуализацию всех компонентов этой сети микротрубочек, поскольку нити раздвигаются для создания силы. Мы также демонстрируем, как эти методы могут быть использованы для зондирования толкающих сил, оказываемых ансамблями кинезин-5, и как вязкие тормозные силы возникают между скользящими парами микротрубочек, сшитыми митотическим MAP PRC1. Эти анализы дают представление о механизмах сборки и функционирования веретена и могут быть более широко адаптированы для изучения плотной сетевой механики микротрубочек в различных контекстах, таких как аксон и дендриты нейронов и полярных эпителиальных клеток.

Введение

Клетки используют сети микротрубочек для выполнения широкого спектра механических задач, начиная от переноса^{пузырьков} ^1,2,3 до сегрегации хромосом во время митоза ^4,5,6. Многие из белков, которые взаимодействуют с микротрубочками, такие как молекулярные моторные белки кинезин и динеин, генерируют силы и регулируются механическими нагрузками. Чтобы лучше понять, как функционируют эти критические молекулы, исследователи использовали одномолекулярные биофизические методы, такие как опти....