يصف هذا البروتوكول تحضير الأنسجة العصبية الوركية الكاملة للفئران للتحفيز الكهروفسيولوجي خارج الجسم الحي وتسجيلها في حمام ملحي منظم بيئيا ومكون من مقصورتين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحضير العصب الوركي للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمكن المستحضرات خارج الجسم الحي من دراسة العديد من العمليات العصبية الفسيولوجية بمعزل عن بقية الجسم مع الحفاظ على بنية الأنسجة المحلية. يصف هذا العمل تحضير الأعصاب الوركية للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي ، بما في ذلك إعداد المخزن المؤقت ، والإجراءات الحيوانية ، وإعداد المعدات ، والتسجيل الفسيولوجي العصبي. يقدم هذا العمل نظرة عامة على الأنواع المختلفة من التجارب الممكنة باستخدام هذه الطريقة. تهدف الطريقة المحددة إلى توفير 6 ساعات من التحفيز والتسجيل على الأنسجة العصبية الطرفية المستخرجة في ظروف خاضعة لرقابة مشددة لتحقيق الاتساق الأمثل في النتائج. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة هي إمكانات العمل المركب من الألياف A (CAP) مع سعات من الذروة إلى الذروة في نطاق المللي فولت طوال مدة التجربة. إن سعات وأشكال CAP متسقة وموثوقة ، مما يجعلها مفيدة لاختبار ومقارنة الأقطاب الكهربائية الجديدة بالنماذج الحالية ، أو آثار التدخلات على الأنسجة ، مثل استخدام المواد الكيميائية أو التعديلات الجراحية أو تقنيات التحفيز العصبي. تم اختبار كل من أقطاب الكفة التقليدية المتاحة تجاريا مع ملامسات البلاتين والإيريديوم وأقطاب المطاط الصناعي الموصلة حسب الطلب وأعطت نتائج مماثلة من حيث الاستجابة لقوة التحفيز العصبي ومدة المدة.
المقدمة
إن الفهم الحالي لوظيفة الأعصاب الأساسية كما هو موضح في silico يفتقر إلى عدة جوانب ، لا سيما فيما يتعلق بآثار تفتيت الأنسجة العصبية خارج السوما والمحور العصبي والتشعبات. لا تزال التفاعلات بين المحور العصبي والمايلين غير مفهومة بشكل جيد كما يتضح من حقيقة أنه حتى نماذج الأعصاب الحسابية التفصيلية مثل MRG1 (لأعصاب الثدييات) التي تلتقط بشكل كاف استجابة التحفيز الكهربائي التقليدية ، لا تلتقط السلوكيات الأخرى المرصودة تجريبيا مثل ترحيل الكتلة عالية التردد2 أو استجابة البداية الثانوية3.
يوفر هذا البروتوكول طريقة للتحقيق بكفاءة في العمليات الفسيولوجية العصبية على مستوى الأعصاب في نموذج حيواني مختبري صغير حاد ، باستخدام بروتوكول إعداد موحد لعزل العصب ، والتحكم في بيئته ، وإزالته من سياق في الجسم الحي إلى سياق خارج الجسم الحي. هذا سيمنع عمليات الجسم الأخرى أو التخدير المستخدم من قبل بروتوكولات تحفيز الأعصاب في الجسم الحي لتغيير سلوك الأعصاب وإرباك النتائج المقاسة أو تفسيرها 4,5. وهذا يمكن من تطوير نماذج أكثر واقعية تركز فقط على التأثيرات الخاصة بالأنسجة العصبية غير المفهومة بشكل جيد. هذا البروتوكول مفيد أيضا كمنصة اختبار لتحفيز الأعصاب الجديدة وتسجيل مواد القطب الكهربائي وهندسته ، بالإضافة إلى نماذج التحفيز الجديدة مثل الكتلة عالية التردد 2,3. تم استخدام اختلافات في هذه التقنية سابقا لدراسة فسيولوجيا الأعصاب في ظروف خاضعة لرقابة مشددة6 ، على سبيل المثال ، لقياس ديناميكيات وخصائص القناة الأيونية أو آثار التخدير الموضعي7.
توفر هذه التقنية العديد من المزايا مقارنة بالبدائل مثل التجارب الحادة في الجسم الحي على الحيوانات الصغيرة8. تغني هذه التقنية عن الحاجة إلى الحفاظ على عمق التخدير حيث تم استخراج الأنسجة من الجسم ، مما يقلل من كمية المعدات المطلوبة مثل ناشر مخدر ، ومكثف الأكسجين ، ووسادة التدفئة. هذا يبسط البروتوكول التجريبي ، مما يقلل من خطر الأخطاء. نظرا لأن التخدير يمكن أن يغير وظيفة الأعصاب4 ، فإن هذه التقنية تضمن عدم الخلط بين التدابير بسبب الآثار الجانبية لهذه المركبات المخدرة. وأخيرا ، هذه التقنية أكثر ملاءمة من التجارب الحادة في الجسم الحي عند دراسة آثار المركبات السامة للأعصاب مثل التيترودوتوكسين ، والتي من شأنها أن تقتل حيوانا مخدرا عن طريق الشلل.
أقسام الأعصاب المحيطية هي نظام فريد من نوعه خارج الجسم الحي لأن هناك فرصة كبيرة لأن الألياف المسؤولة عن الإشارات العصبية المسجلة لا تحتوي على أي سوما. وبما أن هذه الخلايا عادة ما تكون موجودة ، بالنسبة للخلايا العصبية الحركية ، في العمود الفقري ، وللخلايا العصبية الحسية في العقد الجذرية الظهرية بجوار العمود الفقري ، يمكن نمذجة إعداد جزء من عصب الثدييات تقريبا كمجموعة من الأغشية الأنبوبية ذات القنوات الأيونية ، المفتوحة في كلا الطرفين9. يتم الحفاظ على التمثيل الغذائي بواسطة الميتوكوندريا الموجودة في المحور العصبي في وقت تشريح الأنسجة10. يتم تشجيع خياطة الأطراف المفتوحة للمحور بعد الاستخراج لإغلاقها وبالتالي المساعدة في الحفاظ على التدرجات الأيونية الموجودة عبر الغشاء ، والتي تعتبر ضرورية لوظيفة الأعصاب الطبيعية.
للحفاظ على توازن الأنسجة خارج الجسم ، يجب التحكم في العديد من المتغيرات البيئية بإحكام. هذه هي درجة الحرارة11 ، الأوكسجين 12 ، الأسمولية ، الرقم الهيدروجيني13,14 ، والوصول إلى الجلوكوز للحفاظ على التمثيل الغذائي. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتمثل النهج في استخدام مخزن مؤقت معدل Krebs-Henseleit15,16 (mKHB) يتم تهويته باستمرار بمزيج من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون. يقع mKHB في عائلة المخازن المؤقتة القلبية 6,17 المستخدمة للحفاظ على الأنسجة المشرطة خارج الجسم ، على سبيل المثال ، في التجارب خارج الجسم الحي. لا تحتوي هذه المخازن المؤقتة على أي هيموغلوبين أو مضادات حيوية أو مضادات للفطريات ، وبالتالي فهي مناسبة فقط للمستحضرات التي تنطوي على كميات صغيرة من الأنسجة لفترة محدودة. تم تحقيق التحكم في الأس الهيدروجيني باستخدام زوج الأكسدة والاختزال الكربوني وثاني أكسيد الكربون ، مما يتطلب تهوية مستمرة للمخزن المؤقت مع ثاني أكسيد الكربون للحفاظ على توازن الأس الهيدروجيني. هذا لتجنب استخدام عوامل التخزين المؤقت الشائعة الأخرى مثل HEPES ، والتي يمكن أن تعدل وظيفة الخلايا العصبية18. لأكسجة المخزن المؤقت وتوفير التحكم في درجة الحموضة ، تم استخدام خليط من 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الأكسجين يسمى carbogen (95٪ O 2 ، 5٪ CO2). تم استخدام محرك تسخين للتحكم في درجة حرارة حاوية عازلة ، وتم تشغيل المخزن المؤقت من خلال حمام عصبي ، ثم أعيد تدويره إلى حاوية البداية. تستمر التجربة النموذجية من 6 إلى 8 ساعات قبل أن يفقد العصب قدرته على البقاء ولم يعد يستجيب بما فيه الكفاية للتحفيز لاتخاذ تدابير تمثل الأنسجة السليمة.
لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، تم استخدام أقطاب كلوريد الفضة للتسجيل ، والتي تم إعدادها وفقا للطرق الموصوفة سابقا19. للتحفيز ، يمكن استخدام مزيج من أقطاب الكفة البلاتينية التجارية الجاهزة وأقطاب الكفة البوليمرية الموصلة حسب الطلب. تتمتع أقطاب الكفة البوليمرية الموصلة بقدرات شحن أعلى بشكل ملحوظ ، وهي مفيدة عند تحفيز العصب باستخدام الأشكال الموجية عالية السعة20.
تم وصف المحفز المستخدم في هذا البروتوكول سابقا20. الوثائق وملفات التصميم والبرامج النصية لاستخدامها متاحة للجمهور21. يمكن استخدام محفزات أخرى لتنفيذ هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن المحفز المخصص قادر أيضا على كتلة التيار البديل عالي التردد (HFAC) 2,20 ، والتي تمكن مجموعة واسعة من تجارب الفيزيولوجيا العصبية. لاستخدام كتلة HFAC ، يوصى باستخدام أساور مطاطية موصلة لتجنب تلف العصب. الأصفاد العصبية المطاطية الموصلة هي صفائف قطب كهربائية ناعمة وبوليمرية بالكامل يتم إنتاجها من اللدائن الموصلة كمكون موصل و polydimethylsiloxane كعازل22. تم تصنيع الأجهزة في تكوين ثنائي القطب باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق بالليزر التقليدية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع رعاية الحيوانات وإجراءاتها بموجب التراخيص المناسبة الصادرة عن وزارة الداخلية في المملكة المتحدة بموجب قانون الحيوانات (الإجراءات العلمية) (1986) وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس رعاية الحيوان والمراجعة الأخلاقية في إمبريال كوليدج لندن.
1. إعداد المخازن المؤقتة
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الجزء من البروتوكول قبل بقية البروتوكول بوقت كاف، باستثناء الخطوات النهائية التي تنطوي على إعداد المخزن المؤقت المعدل Krebs-Henseleit (mKHB) بتركيز 1x.
- تحضير محلول مخزون 1 مليون كلوريد الصوديوم2
- أضف 14.701 جم من ثنائي هيدرات CaCl2 إلى كوب نظيف سعة 100 مل. أضف ~ 75 مل من الماء منزوع الأيونات وحرك حتى يذوب الملح بالكامل.
- انقل المحلول إلى قارورة متدرجة سعة 100 مل وأضف ماء منزوع الأيونات حتى يتم الوصول إلى حجم 100 مل. انقل المحلول إلى زجاجة وخزنه في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
- تحضير 10x مخزون mKHB المركز
- أضف 66.03 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 3.57 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 1.63 جم من فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH 2 PO4) ، و 1.44 جم من كبريتات المغنيسيوم إلى كوب سعة2لتر.
- أضف ~ 750 مل من الماء منزوع الأيونات إلى الكأس وحرك حتى تذوب الأملاح (قد تكون هناك بلورات ملح صغيرة متبقية في الأسفل). أضف 25 مل من محلول مخزون 1 M CaCl2 (الخطوة 1.1) وحرك ؛ تأكد من أن هذا هو الملح الأخير المضاف.
- انقل المحلول إلى قارورة متدرجة سعة 1 لتر وأضف ماء منزوع الأيونات للوصول إلى حجم إجمالي قدره 1 لتر. تخزين مركزة 10x mKHB في 4 درجة مئوية في الثلاجة.
ملاحظة: يمكن تخزين مخزون mKHB المركز لمدة 1 شهر تقريبا قبل الاستبدال.
- تحضير تشريح طبق بتري (طلاء)
- قم بإعداد طبق بتري زجاجي نظيف (قطره 120 مم) للطلاء عن طريق غسل وتجفيف الطبق بعناية.
- باتباع تعليمات الشركة المصنعة لاستخدام ومعالجة طلاء الألكوكسي المطابق ، قم بتغطية الجزء السفلي من طبق بتري بحوالي 3-5 مم من الطلاء عن طريق صب خليط الطلاء المطابق بعناية في الطبق حتى يتم الوصول إلى السمك المطلوب.
- عالج الطلاء في فرن على حرارة 60 درجة مئوية حتى يصبح ثابتا عند اللمس. طبق تشريح بيتري جاهز الآن.
ملاحظة: التنظيف اللطيف للطبق بعد كل استخدام سيضمن استمرار الطلاء لسنوات قبل الحاجة إلى الاستبدال. عند استبدال الطلاء ، تأكد من إزالة جميع مواد الطلاء قبل تطبيق طلاء جديد. لاحظ أن طلاء الألكوكسي المطابق (جدول المواد) المستخدم في هذا البروتوكول له عمر افتراضي أقصر من عام.
2. استعدادات ما قبل التشريح
ملاحظة: تبدأ هذه الخطوة التجربة. يجب تنفيذ الخطوات التالية في نفس اليوم ، بهذا الترتيب.
- تحضير 1x mKHB
- تحضير كوب نظيف 2 لتر للمخزن المؤقت. انقل 200 مل من مخزون 10x mKHB إلى الكوب سعة 2 لتر. أضف 2.1 جم من كربونات الصوديوم (NaHCO3) و 0.99 جم من سكر العنب اللامائي (D-glucose) إلى الكوب سعة 2 لتر.
- أضف ما يقرب من 1 لتر من الماء منزوع الأيونات إلى الدورق. يحرك المزيج حتى تذوب الأملاح تماما. انقل المحلول إلى قارورة متدرجة سعة 2 لتر وأضف ماء منزوع الأيونات للوصول إلى حجم إجمالي يبلغ 2 لتر.
- انقل المحلول إلى زجاجة زجاجية سعة 2 لتر موضوعة على مقلب تسخين مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: غالبا ما يكون جهاز تحريك التسخين الأصغر غير قادر على الوصول إلى درجة الحرارة المستهدفة البالغة 37 درجة مئوية بسبب القصور الذاتي الحراري للحاويات الكبيرة المليئة بالماء. اضبط درجة الحرارة لأعلى حتى تصل محتويات الزجاجة إلى 37 درجة مئوية مع التحريك. راقب درجة الحرارة أثناء التجربة واخفض درجة الحرارة المحددة في حالة التجاوز. - ضع ميزان حرارة في زجاجة سعة 2 لتر لمراقبة درجة الحرارة ، باستخدام مقابض لمنع تأثر مقياس الحرارة بالبرغوث المتحرك. قم بتهوية المخزن المؤقت باستخدام الكاربوجين لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لأكسجة المحلول. هذا يجب أن يضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. قم بقياس الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني للتأكد من أنه في حدود 0.1 وحدة درجة الحموضة من 7.4 (عند 37 درجة مئوية).
ملاحظة: لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4، استخدم حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم عند الحاجة. - املأ أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي سعة 15 مل وزجاجة سعة 100 مل ب mKHB وضعهما على الجليد ليبرد.
ملاحظة: يمكن تنظيف أنابيب أجهزة الطرد المركزي والزجاجة وإعادة استخدامها بعد كل تجربة دون تعقيم. - بالنسبة للأجزاء اللاحقة من التجربة ، استمر في تهوية المخزن المؤقت في زجاجة سعة 2 لتر باستخدام الكاربوجين عند 37 درجة مئوية مع التحريك المستمر.
ملاحظة: قد يكون الاستخدام غير الخاضع للرقابة للكاربوجين خطيرا إذا لم تكن هناك أنظمة أوتوماتيكية لإيقاف تدفق الغاز في حالة حدوث تسرب. يمكن لمستشعر آلي وصمام إغلاق إلكتروني التخفيف من هذا ؛ خلاف ذلك ، يجب ترك الشخص للإشراف على المعدات إذا تم تشريحها في غرفة مختلفة. في جميع الحالات ، يجب استخدام مستشعر الأكسجين بالقرب من الإعداد لتحذير المشغلين عندما يرتفع تركيز الأكسجين المحيط فوق 25٪. استخدم غرفة ذات تهوية نشطة إن أمكن.
- قم بتشغيل جهاز الحصول على الإشارة ، ومضخم الصوت المسبق منخفض الضوضاء ، وفلتر ضوضاء الخط ، ومنظار الذبذبات للتسجيل والتحفيز ، لإتاحة وقت كاف لتثبيت درجة الحرارة.
- تأكد من تكوين جميع معدات التسجيل الكهربائية بشكل صحيح
- اضبط مضخم الصوت المسبق منخفض الضوضاء على الإدخال المقترن بالتيار المتردد مع ضبط مرشح تمرير نطاق الإدخال على 6 ديسيبل في العقد الواحد، وتعيين ترددات القطع على 30 هرتز و3 كيلو هرتز لمرشحات التمرير العالي والمنخفض على التوالي.
- اضبط كسب مضخم الصوت منخفض الضوضاء على 100.
3. تخدير الحيوانات والقتل الرحيم
ملاحظة: تم استخدام إناث الفئران بين 250 و 330 جم (جدول المواد) في الدراسات.
- إعداد الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية: مقص مستقيم 12 سم (حاد) ؛ 2 مم مقص نابض بزاوية حافة القطع ؛ مقص ناعم 4 سم ، حاد أو شبه حاد ؛ # 7 ملقط دومونت. ملقط ناعم بزاوية 45 درجة و 6-0 خياطة الحرير أو الخيط.
- ضع الفئران في حاوية أو غرفة تخدير. قم بتوصيل الأكسجين والناشر المخدر بالحاوية. اضبط تركيز المخدر (الأيزوفلوران) على 3.5٪ وانتظر حوالي 10 دقائق أو حتى يظهر الحيوان علامات التخدير مثل فقدان منعكس التصحيح.
- بعد أن يظهر الفئران علامات التخدير ، تأكد من فقدان الوعي من خلال اختبار رد الفعل الانسحابي لقرصة إصبع القدم. المضي قدما فقط عندما لا يكون هناك سحب إصبع القدم. خلاف ذلك ، تحقق من جميع الاتصالات ومستويات التخدير في الناشر وكرر الخطوة 3.2.
- أخرج الحيوان من الحاوية واستمر في خلع عنق الرحم ، يليه شق في شريان الفخذ لتأكيد الوفاة.
4. بروتوكول التشريح
ملاحظة: ضع الحيوان مع بطنه لأسفل على طاولة التشريح. كرر الخطوات التالية لكلا الساقين. عادة ، يتم تشريح الساق اليمنى أولا.
- عند تثبيت الكاحل بإحكام بين الإبهام والسبابة والإصبع الأوسط ، قم بقطع وتر الكعب باستخدام مقص حاد مستقيم 12 سم.
- باستخدام مقص حاد ناعم ، قم بعمل شق جلدي من الوتر العقبي على طول الجزء الخلفي من الساق وصولا إلى قاعدة العمود الفقري ، مع الحرص على عدم تشريح الأنسجة العضلية أدناه.
- باستخدام ملقط ناعم ومقص ناعم ، قم بعمل شقوق دقيقة عبر طبقات العضلات بالقرب من منتصف الجزء الخلفي من الساق حتى يتعرض العصب الوركي. بمجرد ظهور العصب الوركي ، رطب التجويف باستخدام mKHB البارد لمنع العصب من الجفاف.
- باستخدام مرقئ الدم ، اسحب لوحات الجلد على كل جانب على حدة ، وحافظ على الشق مفتوحا لأعمال تشريح أدق. بدءا من موقع شق الوتر العقبي ، مع مقص دقيق ، يقطع العضلات على الجانب الإنسي من الساق لتحرير العصب. استمر في الحفاظ على مستويات الرطوبة في المنطقة باستخدام mKHB المثلج البارد.
- عندما يتعرض العصب أثناء التحرك لأعلى الساق ، قم بتشريح الأنسجة العضلية الفوقية. حرر العصب الأقرب إلى العمود الفقري من الأنسجة الضامة حتى الوصول إلى شق العمود الفقري وعند هذه النقطة يوجد خلل في العصب. لا تحاول تنظيف العصب بعد لأن السرعة ضرورية في هذه المرحلة.
- اقطع العصب بالقرب من العمود الفقري قدر الإمكان باستخدام مقص دقيق. لتسهيل التشريح ، اسحب بلطف شديد نهاية العصب بالقرب من الكاحل باستخدام الملقط. لا تقرص العصب في الوسط أبدا ، ولكن فقط النهايات. لا تسحب العصب المشدود أبدا.
اختياري: في هذه المرحلة ، إذا سمح الوقت ، يمكن إجراء خياطة طرفي العصب للمساعدة في الحفاظ على قابلية البقاء. حافظ على التعامل مع الحد الأدنى لمنع الضرر. إذا لم يكن هناك وقت كاف (راجع الخطوة 4.5)، تخطي هذه الخطوة واتبع الخطوة 5.2 لاحقا. - ضع العصب التشريحي في أنبوب جهاز طرد مركزي سعة 15 مل مملوء ب mKHB (الخطوة 2.1.5) ، وأغلق الأنبوب ، وضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد حتى بدء إجراء التنظيف.
- كرر الخطوات من 4.1 إلى 4.7 للساق الأخرى. من الناحية المثالية ، يجب أن يستغرق كل عصب 5-10 دقائق لاستخراجه ، من أجل زيادة صلاحية الأنسجة إلى أقصى حد.
5. إجراء تنظيف الأعصاب
- املأ طبق بتري المطلي في منتصف الطريق تقريبا ب mKHB المؤكسج المبرد. ضع أحد الأعصاب الوركية المشوهة في الطبق وقم بتثبيت طرفي العصب على الطبق بحيث يكون العصب مستقيما دون مكامن الخلل أو الالتواء أو الالتواء. قم بتثبيت العصب بالقرب من النهايات قدر الإمكان.
- باستخدام 6-0 خيوط حريرية أو خيط رفيع ، اربط عقدة مزدوجة حول كل طرف من أطراف العصب لمنع تسرب السيتوسول إلى المخزن المؤقت. ضع العقدة بجوار دبابيس الحشرات مباشرة على الجانب الأقرب إلى مركز العصب ، لأن هذا سيمنع التسرب من الأنسجة العصبية إلى المخزن المؤقت. لا تقم بهذه الخطوة إذا كان العصب مرتبطا مسبقا.
- باستخدام المجهر للدقة والمقص الزنبركي بزاوية 2 مم ، قم بإزالة الدهون والأوعية الدموية والأنسجة العضلية من العصب. تقليم أي فروع عصبية لن تستخدم في بروتوكول التحفيز والتسجيل.
- كل 5 دقائق من التنظيف ، استبدل المخزن المؤقت ب mKHB المؤكسج المبرد الطازج. استخدم الملقط الناعم لسحب الأنسجة الضامة والدهون والأوعية الدموية لتسهيل التشريح.
- ضع الأعصاب مرة أخرى في أنابيب النقل المملوءة ب mKHB المبرد بالأكسجين الطازج ووضع الأنابيب على الجليد.
6. إعداد المعدات
ملاحظة: يوضح الشكل 1 إعداد المعدات المستخدمة لإجراء التجارب. باختصار ، يتكون من حمام عصبي مزدوج المقصورة ، وزجاجة سعة 2 لتر موضوعة على محرك تسخين ، ومصدر للكربوجين للتهوية العازلة ، وأنابيب للسماح للمخزن المؤقت بالتدفق من الزجاجة إلى الحمام ، والعودة إلى الزجاجة باستخدام مضخة تمعجية. يمكن تشكيل الحمام من زجاج شبكي أو مطبوع 3D من مواد مانعة للماء. يبلغ عمقه حوالي 2 سم ، ويتميز القسم الذي يفصل بين غرفتي الحمام بثقب قطره 1.5 مم للسماح بخيوط عصب محيطي عبر كلتا الغرفتين. غرفة واحدة كبيرة ، يجب أن يكون طولها 4 أو 5 سم على الأقل ، وسيتم ملؤها بالمخزن المؤقت. يجب أن يكون طول الغرفة الأخرى 3 سم على الأقل وسيتم ملؤها بالسيليكون أو الزيت المعدني. يجب ألا يكون الحمام كبيرا جدا لأن هذا سيؤدي إلى تدهور التحكم في التروية ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة. قد تكون هناك حاجة إلى أحجام حمام مختلفة اعتمادا على حجم الأنسجة العصبية قيد الدراسة.
- قم بإعداد حمام عصبي نظيف ثنائي الحجرة (انظر الملف التكميلي للحصول على مواصفات التصميم). ضع حمام الأعصاب تحت مستوى الزجاجة سعة 2 لتر الموضوعة على مقلب التسخين ، باستخدام رؤوس ومقابض رئيس المختبر القياسية. قم بتوصيل تصريف الحمام بمدخل المضخة التمعجية.
- قم بتوصيل مخرج المضخة التمعجية بأنبوب يؤدي إلى الزجاجة العازلة سعة 2 لتر. قم بتوصيل مدخل الحمام بأنبوب باستخدام صمام تدفق قابل للتعديل ووضع الأنبوب داخل زجاجة سعة 2 لتر. استخدم صماما ثلاثي الاتجاهات مع حقنة متصلة بالمخرج الأوسط للمساعدة في تحضير الأنبوب كسفون للتدفق العازل بمساعدة الجاذبية.
- قم بتعبئة السيفون عن طريق رسم المحقنة حتى يتدفق المخزن المؤقت إليها. قم بتكوين الصمام بحيث يكون معدل تدفق المخزن المؤقت إلى الحمام ~ 5-6 مل ·min-1. يمكن زيادة التدفق في البداية لملء الحمام. بمجرد وصول مستوى المخزن المؤقت للحمام إلى البالوعة ، ضع الأعصاب في الحمام.
- باستخدام دبوس الحشرات ، قم بتأمين نهاية العصب في زاوية غرفة الحمام المملوءة بالمخزن المؤقت. باستخدام ملقط دقيق بزاوية 45 درجة وقرص العصب فقط في النهايات ، قم بخيط العصب بعناية ليتم تحفيزه من خلال الفتحة الموجودة في القسم بين غرفتي الحمام.
- قم بتأمين الطرف الآخر من العصب في غرفة الزيت في الحمام باستخدام دبوس حشرة ، مما يضمن أن العصب مستقيم دون أن يتم تمديده وخاليا من مكامن الخلل والالتواءات. باستخدام شحوم السيليكون ، قم بعمل ختم لمنع تسرب المخزن المؤقت من غرفة المخزن المؤقت إلى غرفة الزيت. املأ غرفة الزيت بالسيليكون أو الزيت المعدني.
- ضع خطافات قطب تسجيل Ag/AgCl في غرفة حمام الزيت وقم بتأمينها باستخدام رؤوس الرؤساء والقابضين. لف جزء العصب في حمام الزيت فوق الخطافات دون سحب العصب المشدود. لا تقرص العصب. استخدم ملقط بزاوية لرفع العصب دون قرص.
- اضبط أو أصلح ختم شحوم السيليكون إذا لوحظ أي تسرب بعد تحريك العصب.
- قم بتوصيل القطب المرجعي Ag/AgCl بأرض مكبر الصوت وضع القطب الكهربائي في غرفة الحمام المملوءة بالمخزن المؤقت عن طريق تثبيته باستخدام مقبض مختبري.
7. زرع القطب الكهربائي على العصب في الحمام
- قم بإعداد قطب الكفة العصبية النظيف للتحفيز وفقا للمرجع21. ضع القطب الكهربائي في غرفة الحمام المملوءة بالمخزن المؤقت. باستخدام ملقط أو ملاقط دقيقة ذات أطراف حادة أو زاوية، افتح القطب الكهربائي في الحمام لتبلل الجزء الداخلي من الكفة.
- إذا بقيت الفقاعات، استخدم حقنة دقيقة لسحب المخزن المؤقت من الحمام وإجبار الفقاعات على الخروج من الكفة. باستخدام ملاقط تحت العصب ، افتح الكفة بلطف وحركها تحت العصب. أغلق الكفة حول العصب ، مع الحرص على تجنب أي خلل أو التواء في العصب.
- قم بتوصيل قطب التحفيز بالمحفز وقم بتأمين الرصاص قطب التحفيز بالشريط. قم بتوصيل قطب العودة الحالي بالمحفز وقم بتأمين الرصاص بالشريط. إذا كنت تستخدم ورقة بلاتينية مربعة كقطب العودة الحالي ، فضع الورقة بعيدا عن العصب في الحمام.
8. التحفيز والتسجيل
- قم بتوصيل خرج إشارة TTL المحفز بالقناة 4 من الذبذبات ، والتي سيتم استخدامها لتشغيل الذبذبات. على شاشة منظار الذبذبات، اضغط على علامة التبويب قناة المشغل ، وحدد القناة 4 كقناة التشغيل. اضبط مستوى الزناد على 1 فولت باستخدام مقبض المستوى .
- على الذبذبات، اضبط دقة الوقت على 1 مللي ثانية/شعبة ودقة الجهد على 10 مللي فولت/قسمة. قم بتوسيط مرجع المشغل في الوقت المناسب واضبط مستوى المشغل على 1 فولت.
ملاحظة: اتبع الخطوات من 8.3 إلى 8.6 في حالة استخدام المحفز المخصص (راجع جدول المواد). من المفترض أن برامج MATLAB وبرامج تشغيل الأجهزة قد تم تثبيتها على كمبيوتر المختبر باستخدام الإرشادات المقدمة بحرية عبر الإنترنت للمحفز العصبي المخصص21. خلاف ذلك ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لاستخدام محفز متاح تجاريا كبديل. - قم بتوصيل المحفز بكمبيوتر المختبر. قم بتشغيل المحفز عن طريق توصيل مصدر طاقة البطارية بمدخل الطاقة. بدء تشغيل برنامج MATLAB على كمبيوتر المختبر.
- تنفيذ البرنامج النصي MATLAB المخصص: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (جدول المواد).
ملاحظة: يجب أن يومض كبل اتصال USB بين الكمبيوتر والمحفز باللون الأخضر. إذا لم يحدث ذلك ، فهناك خطأ في التكوين ، ويجب التحقق من مصدر الطاقة والاتصالات. - افتح البرنامج النصي MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (جدول المواد). من خلال تحرير البرنامج النصي MATLAB مباشرة ، قم بتعيين المعلمات على النحو التالي: سعة نبض المحفز = -300 μA ، عرض نبضة المحفز = 300 μs ، عدد نبضات المحفز = 10 ووقت المحفز بين النبضات = 1 s.
- ابدأ تشغيل بروتوكول التحفيز بالنقر فوق تشغيل في برنامج MATLAB.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
النتائج التمثيلية التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول هي إمكانات العمل المركب المتسقة من الألياف العصبية من النوع A داخل العصب الوركي. عادة ما يكون لإمكانات الفعل هذه سعة من الذروة إلى الذروة تبلغ حوالي 1 مللي فولت في القطب الكهربائي وبالتالي 100 مللي فولت بمجرد تضخيمها (الشكل 2). يجب أن تسفر سعات التحفيز المماثلة وعروض النبض عن سعات CAP مماثلة. تتطلب أقطاب الكفة المطاطية الموصلة عموما سعات تحفيز أعلى قليلا من أجل الحصول على نفس سعة CAP مقارنة بأقطاب الكفة البلاتينية المتاحة تجاري...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل ، وصفنا بروتوكولا لإعداد الأعصاب الوركية للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي. يستغرق استخراج الأنسجة حوالي 30 دقيقة ، بما في ذلك التعامل مع الحيوانات والتخدير والإعدام والتشريح ، في حين يجب أن يتطلب تنظيف الأعصاب ووضعها في الحمام وزرع القطب الكهربائي 30 دقيقة إضافية قبل بدء التسجيل. يمكن إجراء إعداد المخزن المؤقت في 30 دقيقة ، على الرغم من أنه يمكن القيام بذلك قبل بقية التجربة. تم استخدام هذا النوع من التحضير والتجربة ووصفه في الماضي 7,12<...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
بيان الوصول المفتوح:
لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص الإسناد المشترك الإبداعي (CC BY) (حيثما يسمح به UKRI ، يمكن ذكر "ترخيص الحكومة المفتوحة" أو "رخصة المشاع الإبداعي للإسناد بدون مشتقات (CC BY-ND) بدلا من ذلك) على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ.
مشاركة البيانات:
سيتم توفير البيانات الخام المستخدمة في أرقام هذه المقالة من قبل المؤلفين ، دون تحفظ لا مبرر له.
شكر وتقدير
يعترف المؤلفون بالدكتور جيرالد هونسبيرجر من شركة جلاكسو سميث كلاين للأدوية ، ملك بروسيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وغالفاني للإلكترونيات الحيوية (ستيفناج ، المملكة المتحدة) لمشاركة تقنية تحضير الأعصاب الأصلية معنا. يعترف المؤلفون روبرت توث بتصميم حمام الأعصاب ثنائي الغرفة. يعترف المؤلفون بالتمويل المقدم من منحة جوائز تحدي تقنيات الرعاية الصحية (HTCA) من مجلس أبحاث الهندسة والعلوم الفيزيائية (EPSRC). يعترف المؤلفون بمركز الأنظمة المدمجة والموزعة عالية الأداء للتدريب على الدكتوراه (HiPEDS CDT) التابع لإمبريال كوليدج لندن لتمويل أدريان رابو (EP / L016796/1 ). يتم تمويل Adrien Rapeaux حاليا من قبل معهد أبحاث الخرف في المملكة المتحدة ومركز أبحاث الرعاية والتكنولوجيا. يعترف المؤلفون بامتنان بزاك بيلي من إمبريال كوليدج ، في قسم الهندسة الحيوية ، للمساعدة في التجارب والوصول إلى الأنسجة الحيوانية أثناء إنتاج مقال فيديو JoVE.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| زجاجة زجاجية سعة 1 لتر | VWR International Ltd | 215-1595 | زجاج البورسليكات |
| 1 لتر قارورة زجاجية متدرجة | VWR International Ltd | 612-3626 | زجاج البورسليكات |
| 2 لتر زجاجة زجاجية | VWR International Ltd | 215-1596 | زجاج البورسليكات |
| 2 لتر قارورة زجاجية متدرجة | VWR International Ltd | BRND937254 | زجاج |
| البورسليكاتمحول ، هوائي ، 8 مم إلى 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | محول مستقيم بالدفع لتناسب بين خرطوم الأكسجين وأنبوب تشتت الغاز |
| طلاء مطابق Alkoxy | Farnell | 1971829 | ACC15 طلاء مطابق Alkoxy لتشريح إعداد طبق بتري |
| مخدر | Chanelle | N / A | مخدر استنشاق Isoflurane ، دورق زجاجة 250 مل |
| ، 2 لتر | VWR International Ltd | 213-0469 | زجاج البورسليكات |
| صفعة العصب ثنائية القطب | Cortec GMBH | N / A | 800 ميكرون القطر الداخلي ، الرصاص العمودي للخارج ، لا يوجد إنهاء |
| موصل رؤوس | المختبر الرطب القياسية لربط القابضين بالقضبان ثنائي | ||
| هيدرات كلوريد الكالسيوم | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 جم في زجاجة |
| بلاستيكية علبة الكربوجين | BOC | المركزي لعلبة | N / A |
| بحجم F ، حجم 15 مل | VWR International Ltd | 734-0451 | أنابيب الصقر |
| صفعة العصب المطاطية الموصلة | N / A | N / A | صفعة العصب ذات سعة الشحن العالية للتحفيز ، انظر البروتوكول للحصول على موصل مرجعي للتصنيع |
| ، Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | أن تكون ملحومة بالأسلاك المنتهية بمشابك التمساح (انظر الدخول 11) |
| موصلات مشبك التمساح | RS UK | 212-1203 | يجب أن تكون ملحومة بالأسلاك المنتهية بموصلات TermiMate (انظر الإدخال 10) |
| المياه منزوعة الأيونات | N / A | N / A | تم الحصول عليها من موزع المياه منزوع الأيونات |
| ملقط بزاوية 45 درجة | InterFocus Ltd | 91110-10 | ملقط ناعم ، نطاق الطلاب |
| ملقط قياسي Dumont # 7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | ملقط نطاق الطالب |
| أنبوب منحرف الغاز ، المسامية 3 | Merck | 12547866 | N / A |
| الجلوكوز اللامائي ، مسحوق | VWR International Ltd | 101174Y | 500 جم في زجاجة بلاستيكية |
| القابضون | N / A | N / | A القابضون القياسية الرطبة المثبتة على قضيب |
| المختبر محرك التدفئة | RS المملكة المتحدة | 768-9672 | ستيوارت US152 |
| مرقئ | N / A | N / A | أي مرقئ بطول >12 سم مناسب |
| دبابيس الحشرات ، الفولاذ المقاوم للصدأ ، مقاس 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N / A |
| كمبيوتر محمول | N / A | / A N / | A أي جهاز كمبيوتر محمول آمن للمختبر مع 2 على الأقل من منافذ USB غير المستخدمة مناسب |
| ضوضاء الخط | Digitimer | N / A | مزيل الضوضاء Humbug (مرشح ضوضاء خط 50 هرتز) |
| الضوضاء مكبر للصوت ، SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | مكبر للصوت منخفض الضوضاء |
| ملح كبريتات المغنيسيوم | VWR International Ltd | 291184P | 500g في زجاجة بلاستيكية |
| نصوص MATLAB | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | نصوص التهيئة والمعايرة والتحفيز لبرنامج MATLAB المحفز المخصص |
| Mathworks | N / A | حزمة قياسية | |
| مجهر ضوئي ، PL-2000 | Photonic | N / A | مصدر ضوء مع أعناق بجعة. يمكن الحصول على المنتج من مورد خارجي |
| مجهر ، SMZ 745 | Nikon | SM745 | مجهر |
| زيت معدني ، زيت غير سام | VWR International Ltd | 31911.A1 | لحمام الأعصاب |
| حمام الأعصاب | N / A | N / A | حمام العصب الزجاجي ، انظر البروتوكول للحصول على التفاصيل. |
| راسم الذبذبات | LeCroy | N / A | 434 Wavesurfer. يمكن الحصول على المنتج من موردي الطرف الثالث |
| خرطوم الأكسجين ، 1 متر | BOC | N / A | 1/4 "نهايات NPT |
| منظم الأكسجين | BOC | C106X / 2B: 3.5BAR-BS3-1 / 4 "NPTF 230Bar | N / A |
| مضخة التمعجية P-1 | Pharmacia Biotech | N / A | يمكن الحصول على المنتج من مورد طرف ثالث |
| Petri Dish، Glass | VWR International Ltd | 391-0580 ؛ | غير متاح |
| ملح كلوريد البوتاسيوم | Sigma Aldrich | P5405-250 | جم 250 جم في زجاجة بلاستيكية |
| ملح كبريتات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم | ميرك | 1.04873.0250 | 250 جم في زجاجة بلاستيكية |
| مختبرات نهر | الفئران | N / A | Sprague Dawley ، 250-330 جرام ، أنثى |
| القطب المرجعي ، ET072 | eDaQ (أستراليا) | ET072-1 | القطب المرجعي الفضي كلوريد الفضة |
| قضيب N | / A | N / | A قضبان مختبر رطبة قياسية مع تركيبات للحوامل |
| مقياس | Sartorius | N / A | M-POWER SCALE ، لوزن المساحيق. يمكن الحصول على المنتج من موردين |
| خارجيين مقص مستقيم بحافة 12 سم | InterFocus Ltd | 91400-12 | حاد حاد ، نطاق الطلاب |
| جهاز اقتناء الإشارات | كامبريدج للتصميم الإلكتروني | Micro3-1401 | Micro3-1401 |
| شحم سيليكون ADC متعدد القنوات ، | 3821559 | فارنيل | سام لإغلاق قسم الحمام |
| أنابيب سيليكون ، داخلي 2 مم قطر | N / A | N / A | N / A |
| أنابيب سيليكون ، قطر داخلي 5 مم | N / A | N / A | / |
| A سلك فضي | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 مم ، |
| ملح بيكربونات الصوديوم | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 جم في زجاجة |
| بلاستيكية ملح كلوريد الصوديوم | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 كجم في زجاجة |
| بلاستيكيةمقص زنبركي بزاوية 2 مم حافة | InterFocus Ltd | 15010-09 | N / A |
| حامل | N / A | N / | A حوامل مختبر رطبة قياسية مع مآخذ للقضبان |
| محفز | Digitimer | DS3 | DS3 أو محفز مخصص (انظر المراجع) |
| تحريك البراغيث | VWR International Ltd | 442-0270 | للاستخدام مع |
| طرف حقنة التسخين ، حاد ، قطر 1 مم | N / A | N / A | |
| N / A ، حاد ، قطر 2 مم | N / A | N / A | / |
| A حقنة ، بلاستيك ، حجم 10 مل | N / A | / | A حقنة يجب أن يكون لها شريط تركيب قفل |
| لور ، مقاومة للماء | N / A | N / A | لتأمين الأنابيب والأسلاك إلى طاولة العمل |
| ميزان الحرارة | VWR International Ltd | 620-0806 | ميزان حرارة زجاجي |
| USB الطاقة Bank | RS UK | 135-1000 | مخصص محفز التيار الكهربائي ، اشحن بالكامل قبل التجربة. غير مطلوب في حالة استخدام صمام DS3 |
| ، قفل Leuer ، 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | لربط المحقنة بأنبوب تغذية الحمام وسيفون التحضير |
المراجع
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005(2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138(2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271(2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60(2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013(2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033(2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164(2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
