يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية من الأنسجة الدهنية في أجنة اللاحم. تتيح هذه الطريقة العزل مع غلة عالية ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي للخلايا الدهنية. قام تلطيخ الزيت الأحمر O وبقع الدهون / الحمض النووي بقياس القدرة الشحمية للخلايا المعزولة المستحثة بوسائط التمايز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الشحمية الأولية هي نظام تجريبي قيم لفهم المسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي. توفر أجنة الدجاج الفرصة لعزل الخلايا الشهية من المرحلة المبكرة من التطور الدهني. يمكن استخدام هذه الخلية الأولية لتحديد العوامل التي تؤثر على انتشار الخلايا ما قبل الشحمية والتمايز الشحمي المنشأ ، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات المتعلقة بالسمنة في مرحلة الطفولة والسيطرة على ترسب الدهون الزائدة في الدواجن. النمو السريع للأنسجة الدهنية بعد الولادة يهدر الأعلاف بشكل فعال عن طريق تخصيصها بعيدا عن نمو العضلات في الدجاج اللاحم. لذلك ، قد توفر طرق فهم المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية أدلة لتنظيم هذا الميل وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة. تم تصميم هذه الدراسة لتطوير طريقة فعالة للعزل ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي المنشأ للخلايا الشهية المعزولة عن تطوير الأنسجة الدهنية لأجنة الدجاج اللاحم التجاري (نوع اللحوم). تم تحسين الإجراء لإنتاج خلايا ذات صلاحية عالية (~ 98٪) وزيادة القدرة على التمايز إلى خلايا دهنية ناضجة. تدعم هذه الطريقة البسيطة لعزل الخلايا المعقدة، وثقافتها، وتمايزها التحليلات الوظيفية لنمو الدهون وتطورها في الحياة المبكرة.
المقدمة
السمنة هي تهديد صحي عالمي لكل من البالغين والأطفال. الأطفال الذين يعانون من زيادة الوزن أو السمنة هم أكثر عرضة بخمس مرات تقريبا للإصابة بالسمنة مثل البالغين ، مما يعرضهم لخطر متزايد بشكل كبير للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والعديد من الأمراض المصاحبة الأخرى. حوالي 13.4٪ من الأطفال الأمريكيين الذين تتراوح أعمارهم بين 2-5 يعانون من السمنة1 ، مما يدل على أن الميل إلى تراكم الدهون الزائدة في الجسم يمكن أن يبدأ في وقت مبكر جدا من الحياة. لأسباب مختلفة جدا ، فإن تراكم الأنسجة الدهنية الزائدة هو مصدر قلق للدجاج اللاحم (نوع اللحوم). اللاحم الحديث فعال بشكل لا يصدق ولكن لا يزال يتراكم المزيد من الدهون مما هو ضروري من
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة تينيسي. تم الحصول على بيض اللاحم التجاري المخصب حديثا (Cobb 500) من مفرخ محلي. تم احتضان البيض عند 38 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 60٪ حتى تشريحه في الأيام الجنينية 16-18 (E16-E18). تم جمع الأنسجة الدهنية من المستودع تحت الجلد (الفخذي).
1. الاستعداد للعزلة والثقافة
- إعداد غطاء الثقافة والأدوات.
- قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد منطقة عمل في غطاء محرك السيارة الرقائقي. تطهير منطقة العمل وجميع الأدوات عن طريق مسحة مع 70 ٪ من الإيثانول. تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مواد معقمة.
ملاحظة: قم دائما بمسح الحاويات والأدوات ....
- قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد منطقة عمل في غطاء محرك السيارة الرقائقي. تطهير منطقة العمل وجميع الأدوات عن طريق مسحة مع 70 ٪ من الإيثانول. تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مواد معقمة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تشبه الخلايا الأولية البدائية من الناحية المورفولوجية الخلايا الليفية ، مع أشكال غير منتظمة تشبه النجوم ونواة مركزية (الشكل 2A-C). تلتصق الخلايا بسهولة بالبلاستيك المزروع بالأنسجة وتبدأ في التكاثر بعد فترة وجيزة من التعلق. فهي تميز بسرعة وتتراكم قطرات الدهون (الشكل 3D) عند تزويدها بالأحماض الدهنية في الوسائط. الجدوى (98 ٪ ، على أساس استبعاد الصبغة) المبلغ عنها في العزلات الممثلة هنا نموذجية. في حين أن الخلايا قوية إلى حد ما ، فإ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن العديد من البروتوكولات الموصوفة جيدا قد أبلغت عن عزل الخلايا الشهية14،15،16،17 ، فقد تم تحسين عزل الخلايا الشهية الجنينية ، والتي يمكن استخدامها للتحليلات الوظيفية لنمو الدهون في وقت مبكر من الحياة وتطورها في فراخ اللاحم. ينتج عن هذا البروتوكول أسلاف الخلايا الشحمية الجنينية عالية الجدوى مع إمكانات تمايز عالية. علاوة على ذلك ، فإن الإجراء المقدم لعزل الخلايا البدائية لا يقتصر عل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون UT AgResearch وقسم علوم الحيوان على دعم وتحسين هذا البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة وزارة الزراعة الأمريكية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل ماصة | Eppendorf | Z683825 | ماصة أحادية القناة ، 100 - 1000 وميكرو ؛ L |
| 1 مل طرف ماصة | فيشر Scientific | 02-707-402 | |
| 100٪ إيزوبروبانول | فيشر Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 مل قارورة | بيركس | 4980-25 | |
| 37٪ فورمالديهايد | فيشر Scientific | F75P-1GAL | |
| 6 آبار لوحة | فالكون 353046 | ||
| فحص 96 بئر | الأنسجة كوستار | 3632 | |
| 96 بئر ، | كوستار | 3603 | بزراعة الأنسجة |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| ممسحة أعلى مقاعد البدلاء (Kimtechwiper) | كيمبرلي كلارك | 34155 | |
| بيتادين | أعلى & حتى | NDC 1167300334 | 20٪ حل العمل |
| عداد الخلية | Corning | 6749 | |
| مصفاة الخلية ، 40 & مايكرو ؛ m | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| مصل الدجاج | جيبكو | 16110082 | |
| أنابيب الطرد المركزي المخروطية ، 15 مل | VWR | 10025-690 | |
| أنابيب الطرد المركزي المخروطية ، 50 مل | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| ملقط منحني ، 100 مم | مقص جراحي منحني Roboz | Surgical RS-5137 | |
| ، 115 مم | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| مقطر | Millipore | SYNSV0000 | يتم الاستغناء عنه حسب الحاجة |
| DMEM / F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70٪ حل عمل |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | جيبكو | 10437028 | |
| مجهر الفلورسنت | EVOS | M7000 | |
| قارئ الألواح الفلورية | Biotek | Synergy H1 | |
| احباط | رينولدز | رينولدز لفائف رقائق الألومنيوم شديدة التحمل ، 125 قدما مربعا. | |
| حاوية التجميد | الحرارية العلمية | 5100-0001 | |
| الجيلاتين | ميليبور | 4055 | 2٪ محلول عمل |
| مقياس الدم (غرفة العد) | كورنينج | 480200 | 0.1 مم |
| عميق حاضنة | فيشر Scientific | 6845 | |
| معقم الأدوات | VWR | B1205 | |
| حمض اللينوليك الأوليك مجهر محلول العمل الحمضي | Sigma | L9655 | 1x |
| Evos | AMEX1000 | ||
| ماصة | حرارية علمية | 4661070 | ماصات 12 قناة ، 30 - 300 وميكرو ؛ L |
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | S-7907 | ||
| NaH 2< / sub>PO 4< / sub> | S-3139 | ||
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| زيت أحمر O | Sigma | O-0625 | |
| شاكر المداري | IKA | KS130BS1 | |
| منشفة ورقية | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin / Steptomycin (P / S) | Gibco | 15140122 | 1x Working |
| Solution Petri أطباق ، أطباق | فالكون | 351029 | |
| 100 مم ، 60 مم | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reservior Reservior | VWR | 89094-680 | |
| دورق صغير ، 100 مل | Pyrex | 1000-100 | |
| قارئ لوحة مقياس الطيف | Biotek | Synergy H1 | |
| شاش معقم | McKesson | 762703 | |
| ملقط مستقيم ، 120 مم | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| مقص مستقيم ، 140 مم | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 قارورة | Corning | 430639 | حاضنة |
| زراعة الأنسجة | المعالجة بزراعة الأنسجة مصفاة | الأنسجة 50144906 | |
| الحرارية ، 250 & micro ؛ m | بيرس | 87791 | |
| تريبان بلو داين | جيبكو | 15250061 | |
| تريبسين | جيبكو | 15400054 | 0.1٪ |
| ملاقط محلول العمل ، 110 مم | روبوز جراحي | RS-5035 | |
| النوع 1 كولاجيناز | جيبكو | 17100017 | |
| حمام مائي | فيشر ساينتيك | 15-462-10 | |
| ورق الترشيح Whatman الصف 1 | Whatman | 1001-110 |
المراجع
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolutio....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
