ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים. הם מתקשרים עם ממברנות שומנים ויכולים לחוש אך גם ליצור עקמומיות ממברנה בקנה מידה של מיקרון. אנו מתארים בפרוטוקול זה מתודולוגיות in vitro מלמטה למעלה לניתוח עיוותים של ממברנות, קשירת ספטין רגישה לעקמומיות ואולטרה-מבנה של נימה ספטין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מלמטה למעלה בשיטות במבחנה כדי לבחון את הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, עיצוב מחדש של הממברנה והתנהגות הרגישות לעקמומיות של מחיצות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיפוץ ממברנה מתרחש כל הזמן בקרום הפלזמה ובתוך אברוני התאים. כדי לנתח באופן מלא את תפקיד הסביבה (תנאים יוניים, הרכבי חלבונים ושומנים, עקמומיות הממברנה) ואת השותפים השונים הקשורים לתהליכי עיצוב מחדש של ממברנה ספציפיים, אנו נוקטים בגישות מלמטה למעלה במבחנה . בשנים האחרונות יש עניין רב בחשיפת תפקידם של חלבוני ספטין הקשורים למחלות גדולות. ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים חיוניים הנמצאים בכל מקום ומקיימים אינטראקציה עם קרום הפלזמה. הם מעורבים בחלוקת תאים, תנועתיות תאים, נוירו-מורפוגנזה, וזרעונים, בין תפקידים אחרים. לכן, חשוב להבין כיצד ספטינים מתקשרים ומתארגנים בממברנות כדי לגרום לאחר מכן לעיוותים של הממברנות וכיצד הם יכולים להיות רגישים לעקמומיות ממברנה ספציפית. מאמר זה נועד לפענח את יחסי הגומלין בין המבנה האולטרה-מבנה של ספטינים ברמה המולקולרית לבין שיפוץ הממברנה המתרחש בקנה מידה מיקרוני. לשם כך, שמרים ניצנים, ומתחמי ספטין של יונקים באו לידי ביטוי וטוהרו באופן רקומביננטי. לאחר מכן נעשה שימוש בשילוב של בדיקות חוץ גופיות כדי לנתח את ההרכבה העצמית של מחיצות בממברנה. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLBs), שלפוחיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs), שלפוחיות חד-לשוניות גדולות (LUVs) ומצעים גליים שימשו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין הרכבה עצמית של ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ועקמומיות הממברנה.
מבוא
ספטינים הם חלבונים יוצרי חוטים ציטוסקטליים המקיימים אינטראקציה עם ממברנות שומנים. ספטינים נמצאים בכל מקום באאוקריוטים וחיוניים לתפקודים תאיים רבים. הם זוהו כמווסתים העיקריים של חלוקת תאים בשמרים ניצנים ויונקים 1,2. הם מעורבים באירועי עיצוב מחדש של הממברנות, ciliogenesis3, ו spermiogenesis4. בתוך תאי יונקים, ספטינים יכולים גם לקיים אינטראקציה עם אקטין ומיקרוטובולים 5,6,7 בקלסר של Rho GTPases (BORG) תלוי-אופן8. ברקמות שונות (נוירונים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. קביעת עיצוב מחדש של הממברנה באמצעות שלפוחיות חד-עיניות ענקיות (GUVs)
הערה: בחלק זה, GUVs נוצרים כדי לחקות את עיוותי הממברנה שעשויים להיות מושרים על ידי ספטינים בהקשר תאי. ואכן, בתאים, ספטינים נמצאים לעתים קרובות באתרים עם עקמומיות מיקרומטר. לרכבי GUV יש גדלים הנעים בין כמה לעשרות מיקרומטרים והם יכולים להיות מעוותים. לפיכך הם מתאימים לבחון כל דפורמציה הנגרמת על ידי ספטין בקנה מידה של מיקרומטר. שומנים פלואורסצנטיים, כמו גם ספטינים המסומנים באופן פלואורסצנטי (באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]), משמשים למעקב אחר התנהגותם של שומנים וחלבונים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- הכנת מאגרים ופתרונות
- הכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עיוותים של רכבי שטח
תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות טיפוסיות של רכבי שטח שעוצבו מחדש לאחר דגירה באמצעות ספטינים מוצגות באיור 3, בתנאים שבהם ספטינים מתפלמרים. רכבי שטח חשופים (איור 3A) היו כדוריים לחלוטין. עם הדגירה עם יותר מ 50 nM ניצני שמרים חוטים septin, שלפוחית נראה מעוות. עד לריכוז של 100 ננומטר שמרים ניצנים ספטין אוקטאמרים, הבועיות נראו מעוותות, והעיוותים נשארו סטטיים ולכן לא השתנו (איור 3B). מעל 200 ננומטר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאמור, נעשה שימוש בתערובת שומנים המשפרת את שילוב PI(4,5)P2 בתוך דו-שכבת השומנים ובכך מקלה על אינטראקציות בין ממברנת ספטין. ואכן, הראינו במקומות אחרים25 כי מחיצות שמרים ניצנים אינטראקציה עם שלפוחית באופן ספציפי PI(4,5)P2. הרכב שומנים זה הותאם אמפירית מסינון יצירות מרובות וכעת נעשה בו שימוש נרחב על ידי המחברים. PI(4,5)P2 ליפידים צריכים להיות מטופלים בזהירות. פתרונות מלאי חייבים להיות aliquoted בכמויות קטנות, כך בקבוקון מסוים לא נפתח יותר מפעמיים עבור pipetting. חוץ מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לפטרישיה בסראו ודניאל לוי על העצות והדיונים המועילים שלהם. עבודה זו נהנתה מתמיכת ANR (הסוכנות הלאומית דה לה רשרש) למימון הפרויקט "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, והפרויקט "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin ממומן על ידי אקול דוקטורלה "ED564: Physique en Ile de France" ו- Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa נתמך על ידי אוניברסיטת סורבון (AAP Emergence). G.H. Koenderink נתמך על ידי ארגון Nederlandse voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) באמצעות 'BaSyC-בניית תא סינתטי'. מענק כבידה (024.003.019). אנו מודים לסולם התאים של Labex (n) (ANR-11-LABX0038) ולפריז Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). אנו מו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath סוניקטור | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 11504726 | |
| כימיקלים: NaCl, Tris-HCl, סוכרוז, KCl, MgCl2, B-קזאין, כלורופורם, נתרן קקודילאט, חומצה טאנית, אתנול | סיגמא אולדריץ' | ||
| מיקרוסקופ קונפוקלי | ניקון | דיסק מסתובב או קונפוקלי | |
| מייבש נקודה קריטית Leica | מיקרוסיסטמס | CPD300 | |
| מחולל מים נטולי יונים | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ אינטגרלי 3 |
| ביצים L-α- פוספטידילכולין | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| אקדח פליטת שדה SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25%, תמיסה מימית | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| שומן ואקום גבוה, תוכנת Dow corning | VWR | ||
| IMOD | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | חבילת תוכנה ליישור תמונה סדרה מוטה ושחזור תלת מימד | |
| Lacey Formvar/פחמן אלקטרונים מיקרוסקופיה רשתות | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| מאייד מתכת | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (דבקים אופטיים של נורלנד), NOA 71 ו-NOA 81 | מוצרי נורלנד | NOA71, NOA81 | |
| אוסמיום טטראוקסיד 4% | מיקרוסקופיות דלתא | 19170 | |
| אוסמומטר | Lö ser | 15 M | |
| מנקה פלזמה | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| מחולל פלזמה | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדע | ||
| ציוד הקפאת צלילה leica | microsystems | EMGP | |
| שידור מיקרוסקופ אלקטרונים | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדע | 22451 | מוצר זה אינו זמין לרכישה יותר |
| צלחות שעווה, Vitrex | VWR |
מקורות
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
