AlPcS2a介导的染料辅助激光失活（CALI）是一种用于研究活细胞内细胞内囊泡（IVs）时空损伤的有力工具。
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本文内容
摘要
摘要
细胞内囊泡（IVs）通过囊泡内吞进入细胞质而形成。IV的形成涉及多种信号通路的激活，这一过程与IV膜的通透性改变以及内体和溶酶体的形成密切相关。一种名为染料辅助激光失活（chromophore-assisted laser inactivation, CALI）的方法被用于研究IV的形成及其在调控IV过程中的相关物质。CALI是一种基于成像的光动力学方法，可用于研究由膜通透性改变所诱导的信号通路。该方法能够在细胞中对选定的细胞器进行时空特异性的通透性操控。CALI方法已被应用于通过内体和溶酶体的通透化来观察和监测特定分子。已知IV膜的破裂会选择性募集糖结合蛋白，例如半乳糖凝集素-3（galectin-3）。本文所述实验方案描述了利用AlPcS2a 诱导IV破裂，并以galectin-3作为标记物来标记受损溶酶体的方法，该方法有助于研究在不同条件下IV膜破裂及其下游效应的生物学后果。
引言
内体是一种细胞内囊泡（IV），通过胞吞作用形成，随后成熟为溶酶体。多种细胞内信号通路参与了细胞内囊泡的形成；此外，不同的内在和外在刺激均可对细胞内囊泡造成损伤（例如，病原体在感染过程中可从包被膜中逃逸并进入细胞质1）。这一过程通常伴随着胞吞囊泡的破裂2。因此，靶向和破坏细胞内囊泡的技术可用于相关研究3。
光动力疗法（PDT）是一种依赖光照射来杀伤肿瘤或病原体以治疗疾病的治疗方法4。在PDT中，靶向细胞被标记上无毒性的发色团，即光敏剂，这些光敏剂可通过光照在局部被激活5,6。光敏剂吸收光能后转变为激发的单重态，进而形成寿命较长的激发三重态。处于三重态的光敏剂可在氧气存在下发生电子或能量转移，产生活性氧物种（ROS），从而在光照区域内特异性地破坏被标记的细胞7。其效应因光照强度的不同而有所差异8。通过调控光敏剂的浓度和光照强度，可选择性地使靶向生物分子失活而不引起细胞裂解，该过程称为发色团辅助光失活（CALI）9。随着能够特异性标记多....
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方案
1. AlPcS2a 储存液的制备
- 将10 mg的AlPcS2a溶解于400 µL的0.1 M NaOH中。为提高溶解度，于50 °C加热溶液并涡旋振荡。
- 将该溶液与4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，随后使用0.22 µm滤膜过滤，以去除不溶性沉淀物。
- 使用紫外-可见分光光度计测定溶液浓度。AlPcS2a在672 nm处的消光系数为4 x 104 cm-1 M-1。用PBS将AlPcS2a溶液稀释至1 mM浓度，分装为1 mL每份，于-20 °C保存。
2. 转染
注意：Gal3-GFP 用作溶酶体破裂活细胞成像的指示剂。
- 在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养HeLa细胞。用PBS洗涤细胞后，使用胰蛋白酶消化细胞，然后将细胞重悬于含10% FBS的DMEM培养基中。
注意：该方法适用于大多数贴壁细胞系，包括HeLa和A549细胞系。原则上，尽管未对悬浮细胞进行测试，CALI实验也可在悬浮细胞中进行。 - 将300 ng Gal3-GFP质粒溶于25 µL低血清....
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结果
已展示一幅示意图，表示AlPcS2a诱导的IV型内体和溶酶体损伤（图1）。
可使用市售标记物来确定AlPcS2a的染色条件。例如，AlPcS2a斑点与绿色荧光染料的共定位（图2）22。
荧光标记的半乳糖凝集素-3（galectin-3）可作为监测IV损伤的指示剂（图3）。此外，还可通过追踪Gal3点状信号的位置来检测下游信号通路，包括溶酶体修复和溶酶体自噬3,23。Gal3从细胞质快速聚集到受损的IV部位会显著增强Gal3的信号强度，若调整图像对比度以显示细胞质中的Gal3，则Gal3点状信号的强度可能达到饱和。事实上，图.......
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讨论
AlPcS2a 与质膜结合后，通过内吞作用被细胞内化，并最终在溶酶体中积累。因此，通过调整孵育时间，可将 AlPcS2a 定位于不同的亚细胞区室。该方法的一个局限性在于，仅有一部分内体囊泡（IVs）可通过内吞作用被 AlPcS2a 标记，因为 IVs 的膜来源多样，还包括内质网和高尔基体等。此外，AlPcS2a 对早期内体或晚期内体的选择性标记较为困难，然而在亚细胞成像过程中，可利用荧光标记物来区分早期形成的内体与晚期形成的内体。CALI 诱导的 IV 损伤可通过多种染料实现3,24。
损伤程度可通过光的功率和照射时间进行控制。较强的损伤可能导致细胞皱缩或坏死。本文展示了若干IV损伤的指标，可用于确定实验条件。此外，这些指标也可作为受损IV的标记物，提供其随时间变化的亚细胞分布信息。
在临床上，AlPcS2a
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢中国台湾中央研究院生物医学科学研究所（IBMS）炎症核心设施提供的研究支持。该核心设施由中央研究院核心设施与创新仪器项目（AS-CFII-111-213）资助。作者感谢中央研究院（AS）生物医学科学研究所（IBMS）共用仪器核心设施在图像采集方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| 氯化铝(III)酞菁二磺酸（AlPcS）2a) | 前沿科学 | P40632 | |
| 培养皿 | ibidi | 812128-200 | |
| 培养基 | DMEM 培养基，添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素 G 和 100 mg/mL 链霉素 | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | 赛默飞世尔科技 | A4736301 | |
| Gal3-GFP 质粒 | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | 赛默飞世尔科技 | L7526 | 绿色荧光染料 |
| 多孔板 | 珀金埃尔默 | PK-6005550 | |
| NaOH | 赛默飞世尔科技 | Q15895 | |
| OptiMEM | 赛默飞世尔科技 | 31985070 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4 |
| <强>细胞系 | |||
| HeLa细胞系 | ATCC | CCL-2 | 这些方法适用于大多数贴壁细胞系，但需针对不同情况分别确定实验条件。 |
| <强>仪器设备 | |||
| 0.22 µm 滤光片 | 默克 | SLGV013SL | |
| 准直LED光源 (660 nm) | Thorlabs | M660L3-C1 和 DC2100 | 近红外光基于AlPcS2a的激发光谱是理想的选择。 |
| 共聚焦显微镜 | 卡尔·蔡司 | LSM 780 | 长期成像需要使用培养系统。 |
| NanoDrop 2000/2000c 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 红光LED | Tholabs | M660L4-C1 |
参考文献
- Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective....
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重印与许可
