Здесь мы представляем метод визуализации и количественной оценки множественных маркеров, связанных со старением, в отдельных клетках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Химиотерапевтические препараты могут вызывать непоправимое повреждение ДНК в раковых клетках, что приводит к апоптозу или преждевременному старению. В отличие от апоптотической гибели клеток, старение является принципиально иным механизмом, сдерживающим размножение раковых клеток. Десятилетия научных исследований выявили сложные патологические эффекты стареющих раковых клеток в опухолях и микросредах, которые модулируют раковые клетки и стромальные клетки. Новые данные свидетельствуют о том, что старение является мощным прогностическим фактором во время лечения рака, и поэтому быстрое и точное обнаружение стареющих клеток в образцах рака имеет важное значение. В данной работе представлен метод визуализации и выявления вызванного терапией старения (ТИ) в раковых клетках. Диффузные крупные В-клеточные линии лимфомы (DLBCL) обрабатывали мафосфамидом (MAF) или даунорубицином (DN) и исследовали на наличие маркера старения, связанного со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), маркера синтеза ДНК 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и маркера повреждения ДНК gamma-H2AX (γH2AX). Визуализация проточного цитометра может помочь генерировать одноклеточные изображения с высоким разрешением за короткий период времени для одновременной визуализации и количественной оценки трех маркеров в раковых клетках.
Введение
Различные стимулы могут вызвать клеточное старение, заставляя клетки входить в состояние остановки стабильного клеточного цикла. Эти стимулы включают внутренние сигнальные изменения или внешние стрессы. Внутренние сигналы включают прогрессирующее укорочение теломер, изменения в структуре теломер, эпигенетическую модификацию, нарушения протеостаза, митохондриальную дисфункцию и активацию онкогенов. Внешние стрессы включают воспалительные сигналы и /или повреждения тканей, радиационную или химическую обработку и лишение питания 1,2,3,4. Среди....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Клеточные линии DLBCL с лечением мафосфамидом или даунорубицином для индуцирования клеточного старения
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол также работает для адгезивных раковых клеток. В зависимости от размера клетки, семена 1-2 × 105 клеток в одну лунку из 6-луночной пластины и инкубируют пластину в инкубаторе 5% CO2, 37 °C в течение ночи перед обработкой. Этапы протокола такие же, как и для суспензионных ячеек, но с двумя исключениями. Во-первых, клетки должны быть трипсинизированы с пластины после шага 3.4. Во-вторых, этапы промывки выполняются без центрифугирования перед трипсинизацией.
- Подсчитайте D....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Компенсационная матрица была сгенерирована с использованием программного обеспечения для анализа изображений путем загрузки записанных данных одноцветных контрольных образцов. Как показано на дополнительном рисунке S1, при значении коэффициента перекрестных помех 0,248 был обнаружен непренебреживаемый (значение коэффициента ≥ 0,1) световой поток отЭдУ до С12ФДГ, в то время как перекрестные помехи между другими каналами не были значительными. Четыре различные клеточные линии DLBCL обрабатывали .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод исследовал способность к проникновению в старение четырех различных клеточных линий DLBCL при химиотерапии с визуализацией яркого поля и количественной оценкой на основе проточной цитометрии. На одноклеточном уровне мы успешно обнаружили основные C12FDG + EdU-Ki67 + стареющие популяции в обработанных клетках KARPAS422 и WSU-DLCL2 и в меньшей степени в клетках OCI-LY1, в то время как клеточная линия SU-DHL6 была устойчива к лечению. Разница в способности к проникновен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Юн Ю от Университета Иоганна Кеплера в Линце (BERM16108001).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 анти-H2A.X Фосфо (Ser139) Антитело | Biolegend | 613407 | |
| Моноклональное антитело мыши против Ki-67 (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-додеканоиламинофлуоресцеин Di-β-D-галактопиранозид) | 11590276 | Fisher | |
| Scientific Хлорохин-дифосфат | Sigma aldrich | C6628 | |
| Очищающее средство (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Kit Thermo | Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% изопропанола) | Millipore | 1.3704 | |
| Программное обеспечение для анализа изображений (Amnis ИДЕИ 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Программное обеспечение для приборов и визуализации (Amnis ImageStreamX Система проточного цитометра Mk II и программное обеспечение INSPIRE) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| мафосфамид циклогексиламин | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| параформальдегид | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-фенилэтил-&бета;-D-тиогалактозид) | Sigma aldrich | P4902 | |
| сапонин | Sigma aldrich | 47036 | |
| Оболочка | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit для | Luminex | 400041 | |
| (0,4-0,7% гипохлорита) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | ДСМЗ | АСС 575 |
Ссылки
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
