Здесь мы представляем протокол для значительного снижения числа копий митохондриальной ДНК в яйцеклетке крупного рогатого скота (P < 0,0001). Этот метод использует центрифугирование и бисекцию для существенного уменьшения митохондрий ооцитов и может обеспечить повышенную вероятность развития у реконструированных эмбрионов межвидового переноса ядер соматических клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование бисекции для уменьшения митохондриальной ДНК в бычьем ооците
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Межвидовой перенос ядра соматических клеток (iSCNT) может быть использован для спасения исчезающих видов, но в реконструированном эмбрионе существуют две различные популяции митохондриальной ДНК (мтДНК): одна в ооплазме-реципиенте и одна в донорской соматической клетке. Эта митохондриальная гетероплазма может привести к проблемам развития у эмбриона и плода. Протоколы клонирования ручной работы включают бисекцию ооцитов, которая может быть использована для уменьшения числа копий мтДНК, снижения степени митохондриальной гетероплазмы у реконструированного эмбриона. Центрифугирование обнаженных, зрелых бычьих ооцитов произвело видимую митохондриально-плотную фракцию на одном полюсе ооцита. Zonae pellucidae ооцитов удаляли воздействием проназного раствора. Бисекцию проводили с использованием микробелка для удаления видимой фракции митохондрий. qPCR использовался для количественной оценки мтДНК, присутствующей в образцах ДНК, извлеченных из цельных ооцитов и бисекционных оопластов, обеспечивая сравнение числа копий мтДНК до и после бисекции. Числа копий были рассчитаны с использованием пороговых значений цикла, формулы линии регрессии стандартной кривой и соотношения, которое включало соответствующие размеры продуктов ПЦР мтДНК и геномных продуктов ПЦР. Один бычий яйцеклет имел среднее число копий мтДНК (± стандартное отклонение) 137 904 ± 94 768 (n = 38). Один истощенный митохондриями оопласт имел среднее число копий мтДНК 8 442 ± 13 806 (n = 33). Средние копии мтДНК, присутствующие в богатом митохондриями оопласте, составили 79 390 ± 58 526 копиями мтДНК (n = 28). Различия между этими рассчитанными средними показателями указывают на то, что центрифугирование и последующая бисекция могут значительно уменьшить количество копий мтДНК, присутствующих в истощенном митохондриями оопласте, по сравнению с исходным ооцитом (P < 0,0001, определяемого односторонним ANOVA). Снижение мтДНК должно снизить степень митохондриальной гетероплазмы у реконструированного эмбриона, возможно, способствуя стандартному эмбриональному и фетальному развитию. Добавление митохондриального экстракта из соматической донорской клетки также может иметь важное значение для достижения успешного эмбрионального развития.
Введение
Перенос ядра соматических клеток (SCNT) включает слияние энуклеированного ооцита одного животного и соматической клетки животного одного вида. В большинстве случаев ооциты и соматические клетки происходят от одного и того же вида, а показатели рождаемости ниже 6%1. Некоторые исследования включают использование межвидового SCNT (iSCNT), который включает в себя слияние соматической клетки и ооцита, которые происходят от двух разных видов. В этих исследованиях уровень рождаемости даже ниже, чем в SCNT - обычно менее 1%1. Тем не менее, iSCNT имеет возможность использоваться в качестве метода спасения исчезающих видов, поскол....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Следующий протокол соответствует руководящим принципам ухода за животными и этики, предоставленным Университетом штата Юта.
1. Подготовка СМИ
- Перед обработкой яйцеклеток готовят следующие растворы, как описано в таблице 1: 400 мкл раствора гиалуронидазы, 500 мкл среды Т2, 1020 мкл среды T20 и 800 мкл среды T10.
- Разделите среду Т10 на две скважины четырехлуночной пластины, по 400 мкл на скважину. Пометьте одну скважину буквой «М», а вторую — «MR». Поместите в инкубатор с 5%CO2 до окончания бисекции.
- Приготовьте 500 мкл цитохалазина B (CB) / синтетической яйцеводной жи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Количественные результаты ПЦР (qPCR) используются для определения относительных количеств мтДНК, присутствующих в каждом оопласте. Описанная реакция предназначена для усиления области 12S бычьей мтДНК.
Если бисекция прошла успешно, образцы из целых ооцитов и митохондриально-плотных оопластов будут иметь аналогичные значения Ct . Образцы из митохондриально-восстановленных оопластов будут иметь более высокие значения Ct по сравнению с образцами из двух других групп. График .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методы, ранее использовавшиеся для снижения количества копий мтДНК в ооцитах, имеют свои недостатки. Удаление митохондрий из ооцитов на основе микроманипуляции снижает число копий мтДНК в среднем на 64%27. Уникальный метод, ранее использовавшийся для энуклеации, предполагает использование пипеток Пастера малого диаметра и расщепление зоны пеллюцидного ооцита на границе между микрокапью среды и окружающим минеральным маслом. Наряду с использованием центрифугирования ооцитов, этот подход может произ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить своих коллег из Университета штата Юта, исследователей репродуктивных наук в зоопарке Сан-Диего и доктора Ребекку Кришер из Genus PLC.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифуга 1,5 мл | Fisher Scientific | 5408129 | |
| чашка 60 мм | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5424 | |
| Цитохалазин B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Медиа | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Минеральное масло | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Мини-центрифуга | SCILOGEX | D1008 | |
| мтДНК Праймер: Прямой (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| мтДНК Праймер: Обратный (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Спектрофотометр | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Офтальмологический скальпель с алюминиевой ручкой | PFM Medical | 207300633 | Микролезвие для бисекции |
| протеазы/проназы | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-луночный 0,2-мл | ThermoFisher | A28567 | |
| Поисковая пластина | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Синтетическая жидкость для яйцеводов с HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Нагревательная ступень |
Ссылки
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
