结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

摘要

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。

摘要

机械生物学中的一个基本问题是，在细胞生理学和病理学背景下，活细胞如何感知细胞外的机械刺激。人们认为，细胞对外部机械刺激的机械感知是通过膜受体、相关蛋白复合物以及细胞骨架实现的。机械生物学的最新进展表明，位于细胞质中的细胞核本身也能够独立地同时感知机械刺激。然而，目前对于细胞核如何感知、转导并响应机械刺激的机制仍缺乏深入理解，这主要归因于传统工具在获取和量化细胞核力学特性方面面临的技术挑战。本文介绍了一种新型磁力驱动装置的设计、制备与应用，该装置可施加精确且非侵入性的三维机械刺激，直接形变细胞核。通过使用CRISPR/Cas9基因编辑细胞，本研究证明，该工具结合高分辨率共聚焦荧光成像技术，能够揭示单个细胞中机械敏感性YAP蛋白（yes-associated protein）随细胞核形变而变化的实时动态过程。这一简单方法有望填补当前机械生物学领域中的技术空白，并为解决细胞核力信号转导与细胞功能之间关系的知识缺口提供答案。

引言

本研究旨在通过结合直接对细胞核施加机械力的磁性驱动装置与可同时成像细胞亚微结构及功能变化的共聚焦荧光显微技术，开发并应用一种新方法以阐明细胞核的力学生物学机制。细胞可感知包括组织硬度在内的胞外生物物理信号^1,2,3,4，组织液压力和剪切应力^5,6,7表面拓扑/几何结构^8,9,10,11,12，以及拉伸/压缩应力^{13,14,15,1....}

方案

1. CRISPR/Cas9 基因编辑 B2B 细胞的维持

1. 将B2B细胞接种于T25培养瓶中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基进行培养。
2. 将B2B细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中维持培养。
3. 当细胞融合度达到70%至80%时，对B2B细胞进行传代培养。
4. 将B2B细胞系保存于含有10% (v/v) DMSO的RPMI-1640培养基中，并置于-80 °C冰箱中储存。
5. 实验中使用的B2B细胞传代次数应少于10代。

2. 细胞培养

1. 将细胞接种到玻璃底培养皿中。
   1. 将装有 B2B 细胞的培养瓶从培养箱转移至生物安全柜中。
   2. 使用连接真空泵的吸液枪吸除培养瓶中的培养基。
   3. 用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶。 
   4. 使用吸液枪吸除 PBS。
   5. 加入 0.5 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液，使细胞从培养瓶底部脱离。
   6. 将培养瓶放入培养箱中孵育 5 分钟。
   7. 将培养瓶移回生物安全柜，向瓶中加入 5 mL 新鲜培养基，并用移液器反复吹打混匀。
   ....

结果

磁铁移动装置的设计与磁力的应用
为了通过磁性微珠对细胞核施加作用力，设计并构建了一种磁铁移动装置，用于控制磁铁的空间位置。该磁铁移动装置包含一个中央框架、三个旋钮和导轨，可独立调节所连接磁铁在 x、y 和 z 三个方向上的位置，空间分辨率为每转 1.59 mm（图 1A）。当磁铁移动至已导入细胞内的 7 µm 微珠附近时（图 1B），便会通过磁力吸引微珠，并对细胞核施加作用力（图 1C）。作用力的方向和大小由磁铁与微珠之间的相对位置控制。

在本研究中，对微珠施加了两种不同大小的力：（1）当磁铁放置在细胞上方46 mm处时，施加相对较小的力；（2）当磁铁放置在细胞上方13 mm处时，施加相对较大的力。作用于微珠的磁力F可通过以下公式计算⁵⁹：

讨论

磁性微珠的内化（第2.2节）至关重要，因为细胞外的微珠无法直接对细胞核施加力。力的施加与成像（第5.3节） 是 本实验中的关键步骤以及使细胞核变形并引发显著生物学效应所需的力可能因样本而异。本实验中施加的力大小（0.8 nN 和 1.4 nN）可进一步提高，以在敏感性较低的细胞中触发细胞核的机械感应。

为了以高通量方式定量施加磁力，单个微珠内化是一种理想的方法。本研究中，细胞内化单个微珠的比例在12小时（26%）和24小时（28%）时相似，而未内化微珠的细胞比例在12小时（53%）高于24小时（20%）（图3B）。考虑到可内化更多微珠并更好地控制细胞，12小时被认为是施力实验的最佳时间点。对于不同的细胞系和微珠尺寸，应测试共培养时间与微珠浓度，以确定相应的最佳条件。

在实验中，微珠未经过特异性结合细胞核的包被处理。因此，从微珠直接传递到细胞核的力可能仅为压缩力。结果显示，YAP的核质比随细胞群体的增加而升高，随细胞群体的减少而降低。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05 % 胰蛋白酶	康宁	25-051-CI
25 cm2 烧瓶	康宁	156340
7-µm 平均直径羰基铁微珠	N/A	N/A
A1R 共聚焦系统	尼康
羰基铁粉 CM	BASF	30042253	磁性微珠
培养基（RPMI-1640）	Gibco	11875093
台式计算机	Dell		搭载 Windows 10 操作系统
环境舱 TIZB	东海日立	TIZB
胎牛血清（FBS）	Gibco	26140
Fiji ImageJ	美国国立卫生研究院与光学与计算仪器实验室
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C
磁体	K&J Magnetics, Inc.	D99-N52
单色 相机	FLIR	BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements 软件平台	尼康		软件平台
细胞核掩膜 ImageJ 宏			https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650	Biotium	#40082	核染色
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010023
Ti2-E倒置显微镜	尼康
XYZ 移动装置（CAD 文件）			https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover