Summary
تلعب اللوزة دورا رئيسيا في صرع الفص الصدغي ، الذي ينشأ في هذا الهيكل وينتشر منه. تقدم هذه المقالة وصفا مفصلا لتصنيع أقطاب الدماغ العميقة مع كل من وظائف التسجيل والتحفيز. يقدم نموذجا لصرع الفص الصدغي الإنسي الناشئ من اللوزة.
Abstract
اللوزة هي واحدة من أكثر أصول النوبات شيوعا ، ونموذج فأر اللوزة ضروري لتوضيح الصرع. ومع ذلك ، فقد وصفت دراسات قليلة البروتوكول التجريبي بالتفصيل. توضح هذه الورقة العملية الكاملة لصنع نموذج الصرع الكهربائي اللوزة ، مع إدخال طريقة لتصنيع القطب ثنائي القطب. يمكن لهذا القطب أن يحفز ويسجل ، مما يقلل من إصابة الدماغ الناتجة عن زرع أقطاب كهربائية منفصلة للتحفيز والتسجيل. لأغراض تسجيل مخطط كهربية الدماغ على المدى الطويل (EEG) ، تم استخدام حلقات الانزلاق للقضاء على انقطاع السجل الناجم عن تشابك الكابلات والسقوط.
بعد التحفيز الدوري (60 هرتز ، 1 ثانية كل 15 دقيقة) من اللوزة القاعدية (AP: 1.67 مم ، L: 2.7 مم ، V: 4.9 مم) لمدة 19.83 ± 5.742 مرة ، لوحظ إشعال كامل في ستة فئران (تعرف بأنها تحريض ثلاث حلقات مستمرة من الدرجة الخامسة مصنفة حسب مقياس راسين). تم تسجيل مخطط كهربية الدماغ داخل الجمجمة طوال عملية إشعال النار بأكملها ، ولوحظ إفراز صرع في اللوزة الدماغية يستمر 20-70 ثانية بعد الإشعال. لذلك ، هذا بروتوكول قوي لنمذجة الصرع الناشئ من اللوزة ، والطريقة مناسبة للكشف عن دور اللوزة في صرع الفص الصدغي. يساهم هذا البحث في الدراسات المستقبلية حول آليات صرع الفص الصدغي المتوسط والأدوية الجديدة المضادة للصرع.
Introduction
صرع الفص الصدغي (TLE) هو أكثر أنواع الصرع انتشارا ولديه مخاطر عالية للتحول إلى صرع مقاوم للأدوية. الجراحة ، مثل استئصال اللوزة الحميدية الانتقائية ، هي علاج فعال ل TLE ، ولا يزال تكوين الصرع وتكوين المرض قيد التحقيق 1,2. وقد تبين أن التسبب في TLE يحدث ليس فقط في الحصين ولكن أيضا على نطاق واسع في اللوزة3،4. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن كل من تصلب اللوزة وتضخم اللوزة بشكل متكرر كأصول لنوبات TLE 5,6. لا يمكن التقليل من أهمية اللوزة. نموذج اللوزة ضروري لدراسة تكوين الصرع ، وهناك حاجة ماسة إلى توضيح واضح لهذا النموذج.
تم اقتراح عدة نهج للحث على المضبوطات في النماذج الحيوانية. في الماضي ، تم حقن الأدوية المتشنجة داخل الصفاق في مرحلة مبكرة7. على الرغم من أن هذه الطريقة كانت مريحة ، إلا أن موقع بؤر الصرع كان غير مؤكد. مع تطور التكنولوجيا التجسيمية وأطلس الدماغ الحيواني المفصل ، تم تطبيق حقن المخدرات داخل الجمجمة لحل مشكلة التوطين8. ومع ذلك ، أدى عدم التدخل في النوبات الشديدة خلال المرحلة الحادة إلى ارتفاع معدل الوفيات ، وكانت النوبات التلقائية المزمنة مصحوبة بمشكلة تواتر النوبات والنوبات غير المستقرة 9,10. أخيرا ، تم تطوير طريقة إشعال النار الكهربائية ؛ تحفز هذه الطريقة بشكل دوري مناطق معينة من الدماغ عدة مرات ، مما يسمح بإحداث النوبات مع التحكم المحدد في كل من الموقع ووقت البدء11.
ميزة هذه الطريقة هي أن زرع الأقطاب الكهربائية داخل الجمجمة هو الحد الأدنى من التدخل الجراحي12. علاوة على ذلك ، يمكن السيطرة على شدة النوبة عن طريق إنهاء المنبهات ، مما يقلل من الوفيات الناجمة عن النوبات. هذه التغييرات حلت أوجه القصور في الأساليب السابقة. والجدير بالذكر أن هذا النموذج يمكن أن يحاكي بشكل كاف النوبات البشرية وهو مناسب بشكل خاص لدراسة حالة الصرع (SE) بسبب قدرته على تحفيز SE بسرعة13. ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص المخدرات المضادة للصرع14 وفي الدراسات على آلية الصرع. أخيرا ، من المعروف أن اللوزة ترتبط ارتباطا وثيقا بتعديل الذاكرة ومعالجة المكافأة والعاطفة15. غالبا ما تصادف اضطرابات هذه الوظائف العقلية في مرضى الصرع ، وبالتالي ، قد يكون نموذج الصرع اللوزة خيارا أفضل لدراسة المشاكل العاطفية في الصرع16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه التجربة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب في مستشفى Xuanwu ، جامعة العاصمة الطبية. تم الاحتفاظ بجميع الفئران في مختبر الحيوانات في مستشفى Xuanwu ، جامعة العاصمة الطبية. ينقسم هذا البروتوكول إلى أربعة أجزاء. يقدم الجزءان الأولان طريقة بناء القطب والدائرة الكهربائية باستخدام حلقة انزلاق لتوصيل الأقطاب الكهربائية ومعدات تسجيل / تحفيز EEG. يصف الجزء الثالث طريقة تشغيل زرع القطب الكهربائي ، ويعرض الجزء الرابع معلمات تسجيل وتحفيز EEG المستخدمة في نموذج الصرع اللوزة.
1. تصنيع الأقطاب الكهربائية
- احتفظ بالمواد التالية المعدة مسبقا جاهزة: قطعتان بطول 3 سم من سلك التنغستن المطلي بالتفلون (القطر العاري: 76.2 ميكرومتر) ، قطعة واحدة من الأسلاك الفضية (القطر العاري: 127 ميكرومتر) من نفس الطول ، ومجموعة واحدة من دبابيس صف مقاس 2 × 2.
- استخدم ولاعة لحرق أحد طرفي كل سلك تنغستن لإزالة 5 مم من طلاء العزل.
ملاحظة: يتحول سلك التنغستن مع إزالة العزل إلى اللون الأسود ؛ يشار إلى هذا الجزء من سلك التنغستن بالطرف العلوي. - قشر جزءا من الأسلاك متعددة الخيوط متناهية الصغر ولفها من الأسفل إلى الطرف العلوي حيث تبدأ في الظلام ، وتستمر إلى الأعلى. ادمج هذا السلك فائق النعومة (ذو الملمس الناعم) مع سلك التنغستن عن طريق الضغط على أحد طرفيه ولف الطرف الآخر برفق ، مما يتيح تشابك المادتين معا بسهولة.
- اسحب برفق للتأكد من أنها ملفوفة بإحكام وقطع الأسلاك فائقة النعومة الزائدة. حاول الحفاظ على سلك التنغستن مستقيما طوال العملية.
- ثبت دبوس الصف على المشبك الموجود على طاولة اللحام بحيث يكون الجانب الأطول من المسامير متجها للخارج. استخدم إبرة المحقنة لالتقاط بعض معجون اللحام وتطبيقه على المسامير. تسخين شعلة اللحام إلى 320 درجة مئوية ؛ تذوب وتشوه بعض أسلاك القصدير الخالية من الرصاص بطرف الشعلة.
- تداخل الطرف العلوي من سلك التنغستن بإبرة واحدة من دبابيس الصف واستخدم اللحام الموجود على الشعلة لربط سلك التنغستن بالدبوس.
ملاحظة: سيكون من الصعب جدا لحام سلك التنغستن بالمسامير مباشرة دون مساعدة السلك الناعم. - قم بلحام سلك تنغستن آخر وسلك فضي آخر بدبوس الصف بنفس الطريقة بحيث يتوافق كل سلك مع إبرة (انظر الشكل 1 ، ط).
- قطع اثنين من الأنابيب القابلة للتقلص بالحرارة أطول قليلا من الطرف العلوي لسلك التنغستن. ضعها على مفصل اللحام لسلكين من التنغستن ، مع التأكد من تغطية الجزء الموصل بالكامل في الأنبوب بحيث لا يتم وضع دائرة سلكي التنغستن في سلسلة.
ملاحظة: على الرغم من وجود ثلاثة أسلاك ، إذا تم عزل اثنين منها ، فلن تكون الأسلاك الثلاثة في سلسلة ؛ يمكن أيضا إضافة أنبوب إلى السلك الفضي. - قم بإزالة القطب من مشبك طاولة اللحام وأمسك القطب برفق باستخدام كماشة كبيرة ، حيث يسهل على الأقطاب الكهربائية أن تفقد شكلها عند تسخين الأنبوب القابل للتقلص ، باستخدام مشبك توصيل حراري جيد بقوة أكبر قليلا.
- قم بتشغيل مجرى الهواء وتسخينه حتى تصل درجة الحرارة إلى 320 درجة مئوية. انفخ الأنبوب القابل للتقلص بالحرارة لعدة ثوان حتى يتم شده (انظر الشكل 1 ، ii).
- إذا انفصلت الإبر عن الجسم البلاستيكي أثناء عملية اللحام ، فقم بلصق جزء اللحام والجسم البلاستيكي بمادة لاصقة تذوب بالحرارة (انظر الشكل 1 ، iii). احرص على عدم تشويهه على الواجهة لأن ذلك قد يؤثر على إدخال الواجهة.
- امسك سلكي التنغستن ولفهما معا ، مع إبقاء نهاياتهما متباعدتين (انظر الشكل 1 ، الرابع). قم بقص أسلاك التنغستن الملتوية إلى حوالي 10 مم بحيث لا يتجاوز الفصل في النهايات 0.5 مم.
ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوة قبل زرع القطب للسماح بتعديل مرن لطول القطب. - تسخين مسدس الغراء وتطبيق الغراء بالتساوي حول القطب.
- تحقق من الأقطاب الكهربائية بمقياس متعدد: ضع شريطا واحدا من المتر المتعدد على الجانب غير الملحوم من دبابيس الصف ، والمس برفق نهاية سلك التنغستن أو السلك الفضي بالشريط الآخر ، وتحقق مما إذا كانت الدائرة سلسة. تأكد من عدم وضع الخطوط في سلسلة.
2. اتصال حلقة الانزلاق ووصف الدائرة
ملاحظة: عندما يتم توصيل الأقطاب الكهربائية الموجودة على الفئران بجهاز EEG عبر الكابلات في حالة الحركة الحرة ، يمكن أن تتشابك الكابلات مع تحرك الفئران واستدارتها. يؤدي هذا إلى أن تصبح الكابلات أقصر ، مما يعيق الفئران في النهاية من الحركة أو يتسبب في سقوط الكابلات من رؤوسها. في الطريقة الموضحة هنا ، يتم إدخال حلقة انزلاق رباعية القنوات لمنع الكابلات من السقوط. يتم تمثيل القنوات الأربع بأربعة ألوان في الشكل 1B.
- انزع 5 مم من الجلد العازل في كل طرف لكشف السلك المعدني بالداخل.
- أضف قسما من الأنبوب القابل للتقلص بالحرارة إلى كل سلك من سلك الجزء الثابت.
- قم بلحام كل سلك بقابس موصل جهاز EEG.
- تقليص الأنبوب القابل للتقلص بالحرارة بالهواء الساخن.
- أضف قسما من الأنبوب القابل للتقلص بالحرارة إلى كل سلك دوار.
- قم بربط الأجزاء الموصلة من الأسلاك الحمراء والبرتقالية معا ولحامها بمفصل في الرأس لتناسب دبوس الصف.
- قم بلحام السلكين الآخرين على الرأس لكل مفصل.
ملاحظة: القناة البنية التي تتوافق مع السلك الفضي متصلة بجهاز EEG للتأريض. تستقبل القنوات الحمراء والبرتقالية إشارات من نفس سلك التنغستن ، وتعمل القناة البرتقالية كمرجع لجهاز EEG. الإشارات في القناة الحمراء لا معنى لها ، لكن يجب أن تتعايش مع القناة السوداء لتشكيل حافز حالي. الإشارات في القناة السوداء هي الإشارات الكهربائية الحقيقية في الدماغ. يمكن تصميم دوائر مختلفة بحلقات انزلاق متعددة القنوات لتناسب الأجهزة المختلفة.
3. جراحة للزرع
- الحيوانات
- استخدم C57BL / 6 ذكور الفئران من النوع البري البالغة من العمر 8 أسابيع ، والتي تزن 24-26 جم ، لإجراء العمليات الجراحية.
- قم بإيوائهم بدورة 12 ساعة من الضوء والظلام (وقت الضوء: 8: 00-20: 00) في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها (22 ± 1 درجة مئوية) وتوفير المياه والأعلاف حسب الحاجة.
- استخدم حصيرة حرارية إضافية للحفاظ على دفء الحيوانات أثناء الجراحة.
- بعد الجراحة، يتم حقن ميلوكسيكام تحت الجلد (10 ملغ/كغ) كأول جرعة من المسكنات. ثم ضع الحيوانات في أقفاص منفصلة لتحسين التعافي. أضف ميلوكسيكام إلى النظام الغذائي للحيوان في الأسبوع الأول بعد الجراحة.
- بعد التجربة ، غرس البطينين الأيسر للفئران مع 4 ٪ بارافورمالدهيد تحت التخدير ، وجمع أنسجة المخ للتحقق النسيجي من هدف القطب.
- وزن الماوس وتخديره عن طريق الحقن داخل الصفاق من محلول بنتوباربيتال 1 ٪. تعقيم جميع الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية التي سيتم استخدامها ، بما في ذلك لقم الثقب ، والأقطاب الكهربائية ، وأسمنت الأسنان ، وما إلى ذلك ، عن طريق التعقيم.
- عندما يتم تخدير الماوس تماما ، احلق الشعر من العين إلى منطقة الأذن باستخدام ماكينة حلاقة.
- إصلاح الماوس على الإطار المجسم. ضع الأسنان العلوية الأمامية في شريط القاطعة وأدخل كلا قضيبي الأذن بعمق متساو في الأذنين. ضع مرهم العين الاريثروميسين على العينين لمنع الجفاف والعمى الناجم عن الضوء الساطع أثناء الجراحة.
- تطهير المنطقة الجراحية بثلاث مسحات متناوبة من اليودوفور و 75 ٪ من الكحول في حركة دائرية. بعد ذلك ، قم بعمل شق سهمي للأمام من منتصف هذا الشق ، واقطع الجلد على جانبي الشق لإنشاء نافذة مثلثة.
- لف قطعة صغيرة من القطن في كرة ورطبها بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين. قم بإزالة الأنسجة الرخوة المتصلة بالجمجمة عن طريق فرك المنطقة المكشوفة برفق باستخدام كرة قطنية صغيرة حتى يتم رؤية اليافوخ الأمامي والخلفي بوضوح.
- اضبط الارتفاعات الأمامية والخلفية بحيث يكون اليافوخ الأمامي والخلفي في الوضع الأفقي. ضع في اعتبارك أن موضع اليافوخ الأمامي هو أصل المحاور.
- ثبت برغيا من الفولاذ المقاوم للصدأ على جمجمة المخيخ الأيسر ، باستخدام مثقاب لإنشاء سطح مستو. تأكد من أن المسمار يبرز في منتصف الطريق خارج الجمجمة.
- تأكد من أن إحداثيات إشعال اللوزة هي −1.67 مم خلفي ، -2.7 مم جانبي ، و -4.9 مم بطني من بريجما. اضبط جهاز التجسيم لتحديد موقع هذه البقعة ووضع علامة عليها.
- حفر حفرة على بقعة محددة مع حفر الجمجمة قطرها 0.5 ملم.
- ثبت الأقطاب الكهربائية على قضيب تحديد موقع الجهاز التجسيمي ، ضع القطب عموديا فوق الفتحة ، وقم بإسقاط الموضع إلى -4.9 مم ببطء. لف السلك الفضي حول المسمار ثلاث مرات ، مع الحرص على عدم هز جسم القطب أثناء التشغيل.
- امزج الأسمنت السني وضعه برفق على القطب وسطح الجمجمة. عندما يصلب الأسمنت السني ، قم بتعديل الجزء الخارجي حتى يتحول الأسمنت الذي يحيط بالقطب الثابت إلى مخروط.
- عندما يصلب الأسمنت ، حرر القطب من الجهاز المجسم. يتم تطبيق ميلوكسيكام 10 ملغ/ كغ تحت الجلد لتخفيف الانزعاج الناجم عن الألم عند الحيوانات. تطبيق ميلوكسيكام على الأغذية الحيوانية لتأثير مسكن في الأسبوع الأول بعد الجراحة. قم بإزالة الماوس ووضعه مرة أخرى في القفص ، مع إبقائه منفصلا عن الفئران الأخرى.
4. إشعال الكهربائية
- السماح للفئران للراحة لمدة 1 أسبوع على الأقل بعد الجراحة قبل إشعال النار للسماح للانتعاش بعد العملية الجراحية والسماح للالتهاب أن تهدأ.
ملاحظة: بشكل عام ، الفئران التي لم تتعاف بشكل كاف لا تستجيب بشكل جيد للإشعال. - ضع الماوس في صندوق مخصص به كبلات حلقة انزلاقية تربط القطب على رأس الماوس وجهاز EEG. قم بتشغيل الكابل من خلال فتحة في غطاء الصندوق ، واضبط الطول الأيسر في الصندوق للسماح للماوس بالتحرك بحرية.
- قم بتشغيل جهاز EEG وتحقق مما إذا كان يعمل بشكل صحيح. اضبط المحفز لتقديم نبضات موجة مربعة أحادية الطور 1 مللي ثانية عند 60 هرتز لمدة قطار 1 ثانية.
- ابدأ بكثافة تيار تبلغ 50 μA للتحفيز الأول ؛ مراقبة EEG لما بعد التفريغ ، والذي يتميز بارتفاعات عالية التردد. إذا لم يلاحظ أي تفريغ لاحق ، أضف 25 μA إلى التحفيز التالي ، واستمر في هذه العملية كل 10 دقائق حتى يتم ملاحظة التفريغ اللاحق ويستمر 5 ثوان.
ملاحظة: إذا كانت التجربة لا تتطلب تفريغا ، فيمكن تخطي الخطوة 4.4 ؛ 300 μA قوية بما يكفي لإشعال النار. - حفز الماوس بالكثافة الحالية المحددة في الخطوة 4.3 كل 15 دقيقة ، لا تزيد عن 20 مرة في اليوم.
- مراقبة الاستجابات السلوكية للتحفيز.
ملاحظة: يعتبر حدوث ثلاث حلقات متتالية من الدرجة الخامسة بمثابة إشعال كامل ، جنبا إلى جنب مع معيار رتبةراسين 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتيح القطب والدائرة تسجيل مخطط كهربية الدماغ والعمل كتحفيز (الشكل 1) ؛ يتجنب هذا الإعداد تعقيد تسجيل الزرع وتحفيز الأقطاب الكهربائية بشكل منفصل ويقلل من تلف أنسجة المخ. يسمح تطبيق حلقات الانزلاق بتوصيل القطب الكهربائي بجميع أنواع الأجهزة.
أجرينا جراحة زرع القطب الكهربائي على ستة ذكور بالغين أصحاء C57BL / 6 الفئران ، وتم إجراء التحفيز الكهربائي بعد 2 أسابيع من الجراحة. زاد مستوى النوبات السلوكية تدريجيا مع زيادة عدد المحفزات ، ويستند التصنيف إلى مقياس راسين: 1 = أتمتة الفم أو الوجه. 2 = اثنين أو أقل من الهزات الرمعية العضلية ؛ 3 = ثلاثة أو أكثر من الهزات الرمعية العضلية و / أو الرمع الأمامي ؛ 4 = منشط الرمع الأمامي وتمديد الظهر ؛ 5 = منشط الرمع الأمامي وتمديد الظهر مع التربية والانهيار ؛ 6 = منشط الرمع الأمامي وتمديد الظهر مع الجري البري أو القفز14. تم تسجيل عدد المحفزات المطلوبة لإشعال النار الكامل (الجدول 1).
يوضح الشكل 2 النتائج التمثيلية لمخطط كهربية الدماغ للتحفيز بعد الإشعال الكامل. تستمر عمليات ما بعد التفريغ من 5 إلى 15 ثانية ؛ ثم ، تكثف التصريفات التلقائية داخل الجمجمة ، وتبدأ الأعراض السلوكية. مدة النوبة عادة ما تكون أقل من 1 دقيقة ، مما يقلل من خطر الوفاة من التشنجات الشديدة التي تؤدي إلى انقطاع النفس.
تم الكشف عن التعبير عن c-Fos في أنسجة المخ بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية بعد 2 ساعة من الإشعال الكامل (الشكل 3) ؛ تم استخدام الجسم المضاد c-Fos و Alexa Fluor 488 المترافق للحمار المضاد للأرانب IgG. أظهرت النتائج أن تعبير c-Fos في اللوزة المماثلة قد زاد بشكل كبير ، مما تحقق من جدوى هذا النموذج.
خضعت جميع الحيوانات للتحقق النسيجي في نهاية التجربة للتأكد من دقة هدف التحفيز ، ويظهر مسار القطب في الشكل 4.
الشكل 1: الخطوات الرئيسية في تصنيع الأقطاب الكهربائية. (أ) ظهور الأقطاب الكهربائية في درجات مختلفة؛ يتم وضع علامة على الخطوات المقابلة على الرسوم البيانية. (ب) تتصل حلقة الانزلاق بمقابس الواجهة ؛ تظهر دائرة الرأس الأنثوية في الجزء الداخلي (أعلى اليمين). أشرطة المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: النتائج التمثيلية لتخطيط كهربية الدماغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تعبير c-Fos في اللوزة. c-Fos (أخضر) في الخلايا العصبية اللوزة ؛ DAPI (الأزرق) يسمي النواة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (أ) c-Fos في اللوزة المماثلة ؛ (ب) c-Fos في اللوزة المقابلة. اختصار: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينييندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحقق النسيجي من مسار القطب. تشير الأسهم الحمراء إلى مسار القطب ، والبيضاوي الأبيض المتقطع هو اللوزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| عدد المحفزات | 24 | 12 | 18 | 21 | 16 | 28 |
| المعدل: 19.83 الانحراف المعياري: 5.742 | ||||||
الجدول 1: عدد المحفزات المطلوبة لكل من الفئران الستة ليتم إشعالها بالكامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الصرع هو مجموعة من الأمراض ذات المظاهر المتعددة والأسباب المتنوعة18 ؛ تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن استخدام نموذج واحد لجميع أنواع الصرع ، ويجب على الباحثين اختيار نموذج مناسب لدراستهم المحددة. تقدم الدراسة الحالية واحدة من أكثر الطرق التي يمكن الوصول إليها لتصنيع الأقطاب الكهربائية. يمكن تعديل أجزاء مختلفة من هذه الطريقة للتكيف مع الظروف التجريبية المختلفة.
تستخدم هذه الطريقة أقطاب كهربائية مع كل من وظائف التحفيز والتسجيل ، مما يقلل من إصابة دماغ الحيوان الناتجة عن زرع أقطاب كهربائية منفصلة للتحفيز وتسجيل EEG. عند تصنيع الأقطاب الكهربائية ، يمكن اختيار أحجام مختلفة من دبابيس الصفوف. يمكن توصيل دبابيس الصف الضخمة بحلقة الانزلاق بحزم أكبر. ومع ذلك ، قد تحتاج إلى زرع أشياء متعددة في رأس الحيوان. في هذه الحالة ، يمكن اختيار دبابيس صف صغيرة لأنها تشغل مساحة أقل وأسهل في التشغيل ، ويمكن استخدام حلقة انزلاق متعددة القنوات لتوصيل جميع الأقطاب الكهربائية المزروعة. يمكن لحلقات الانزلاق لحام أنواع مختلفة من الواجهات لتلبية احتياجات أجهزة EEG المختبرية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تسمح للحيوان بالتحرك بحرية دون أن تتشابك الكابلات.
لضمان عدم سقوط الأقطاب الكهربائية على مدى فترة طويلة ، من الضروري استخدام الأسمنت السني بعد جفاف الجمجمة تماما. يمكن لبعض الجروح الأفقية والرأسية على سطح الجمجمة مقدما أن تزيد من الصلابة. بعد الجراحة ، يجب أن تتعافى الحيوانات لمدة أسبوع على الأقل للسماح للالتهاب بالهدوء ، ويمكن استخدام الأدوية المضادة للالتهابات حسب الاقتضاء للمساعدة في الشفاء. لا ينصح بإجراء تجارب أخرى خلال هذا الأسبوع.
على الرغم من مزايا هذا النهج ، فإن الطريقة لها العديد من القيود. نظرا لصغر حجم دماغ الفأر ، قد لا يتم تضمين القطب بدقة في الموقع المستهدف أثناء جراحة التوضيع التجسيمي13. بالمقارنة مع طرق النمذجة الأخرى ، تتطلب هذه الطريقة من الحيوان حمل الكائن المزروع لفترة طويلة ؛ هذا حتما له تأثير على الحيوانات. على سبيل المثال ، وجدنا أن الحيوانات غالبا ما تخدش رؤوسها لأنها كانت غير مريحة.
يمكن استخدام هذه الطريقة مع مجموعة متنوعة من التقنيات ، مثل الفيزيولوجيا الكهربية19 ، ومشبك التصحيح20 وتقنيات علم البصريات الوراثية. ومع ذلك ، فهي ليست مناسبة للتجارب التي تستخدم تحفيز الحلقةالمغلقة 21. قد لا تكون الطرق التي تستخدم نفس معلمات التحفيز ممثلة للنوبة التلقائية الطبيعية ، مما يعني أنها غير مناسبة للتعلم الآلي. في الختام ، تستبعد طريقة إشعال النار الكهربائية هذه تأثير استقلاب الدواء على التجربة ويمكن الوصول إليها ومستقرة وموثوقة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع في العديد من الدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82030037 ، 81871009) ولجنة الصحة البلدية في بكين (11000022T000000444685). نشكر TopEdit (www.topeditsci.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | invitrogen | A-21206 | |
| c-Fos antibody | ab222699 | ||
| Cranial drill | SANS | SA302 | |
| dental cement | NISSIN | ||
| EEG recording and stimulation equipment | Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd | NSHHFS-210803 | |
| lead-free tin wire | BAKON | ||
| Pin header/Female header | XIANMISI | spacing of 1.27 mm | |
| Silver wire | A-M systems | 786000 | |
| Slip ring | Senring Electronics Co.,Ltd | SNM008-04 | |
| Tungsten wire | A-M systems | 796000 | |
| ultrafine multi-stand wire | Shenzhen Chengxing wire and cable | UL10064-FEP | |
| welding equipment | BAKON | BK881 |
References
- Kurita, T., Sakurai, K., Takeda, Y., Horinouchi, T., Kusumi, I. Very long-term outcome of non-surgically treated patients with temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis: A retrospective study. PLoS One. 11 (7), 0159464 (2016).
- Choy, M., Duffy, B. A., Lee, J. H.
- Aroniadou-Anderjaska, V., Fritsch, B., Qashu, F., Braga, M. F. Pathology and pathophysiology of the amygdala in epileptogenesis and epilepsy. Epilepsy Research. 78 (2-3), 102-116 (2008).
- Smith, P. D., McLean, K. J., Murphy, M. A., Turnley, A. M., Cook, M. J. Seizures, not hippocampal neuronal death, provoke neurogenesis in a mouse rapid electrical amygdala kindling model of seizures. Neuroscience. 136 (2), 405-415 (2005).
- Reyes, A., et al. Amygdala enlargement: Temporal lobe epilepsy subtype or nonspecific finding. Epilepsy Research. 132, 34-40 (2017).
- Fan, Z., et al. Diagnosis and surgical treatment of non-lesional temporal lobe epilepsy with unilateral amygdala enlargement. Neurological Sciences. 42 (6), 2353-2361 (2021).
- Dhir, A. Pentylenetetrazol (PTZ) kindling model of epilepsy. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9 37 (2012).
- Van Erum, J., Van Dam, D., De Deyn, P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy & Behavior. 95, 51-55 (2019).
- Carriero, G., et al. A guinea pig model of mesial temporal lobe epilepsy following nonconvulsive status epilepticus induced by unilateral intrahippocampal injection of kainic acid. Epilepsia. 53 (11), 1917-1927 (2012).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience Biobehavioral Reviews. 37, 10 Pt 2 2887-2899 (2013).
- Fujita, A., Ota, M., Kato, K. Urinary volatile metabolites of amygdala-kindled mice reveal novel biomarkers associated with temporal lobe epilepsy. Scientific Reports. 9 (1), 10586 (2019).
- Li, J. J., et al. The spatiotemporal dynamics of phase synchronization during epileptogenesis in amygdala-kindling mice. PLoS One. 11 (4), 0153897 (2016).
- Wang, Y., Wei, P., Yan, F., Luo, Y., Zhao, G. Animal models of epilepsy: A phenotype-oriented review. Aging and Disease. 13 (1), 215-231 (2022).
- Fallah, M. S., Dlugosz, L., Scott, B. W., Thompson, M. D., Burnham, W. M. Antiseizure effects of the cannabinoids in the amygdala-kindling model. Epilepsia. 62 (9), 2274-2282 (2021).
- Chipika, R. H., et al. Amygdala pathology in amyotrophic lateral sclerosis and primary lateral sclerosis. Journal of the Neurological Sciences. 417, 117039 (2020).
- Kuchukhidze, G., et al. Emotional recognition in patients with mesial temporal epilepsy associated with enlarged amygdala. Frontiers in Neurology. 12, 803787 (2021).
- Soper, C., Wicker, E., Kulick, C. V., N'Gouemo, P., Forcelli, P. A. Optogenetic activation of superior colliculus neurons suppresses seizures originating in diverse brain networks. Neurobiology of Disease. 87, 102-115 (2016).
- Devinsky, O., et al.
- Zhang, Z., et al. Interaction between thalamus and hippocampus in termination of amygdala-kindled seizures in mice. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2016, 9580724 (2016).
- Ghotbedin, Z., Janahmadi, M., Mirnajafi-Zadeh, J., Behzadi, G., Semnanian, S. Electrical low frequency stimulation of the kindling site preserves the electrophysiological properties of the rat hippocampal CA1 pyramidal neurons from the destructive effects of amygdala kindling: the basis for a possible promising epilepsy therapy. Brain Stimulation. 6 (4), 515-523 (2013).
- Hristova, K., et al. Medial septal GABAergic neurons reduce seizure duration upon optogenetic closed-loop stimulation. Brain. 144 (5), 1576-1589 (2021).
