Дальнекрасный флуоресцентный датчик старения, связанный с β-галактозидазой для идентификации и обогащения стареющих опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии

Summary

Представлен протокол флуоресцентной, проточной цитометрической количественной оценки стареющих раковых клеток, индуцированных химиотерапевтическими препаратами в клеточной культуре или в моделях опухолей мышей. Необязательные процедуры включают совместное иммуноиммунтирование, фиксацию образца для облегчения анализа больших партий или временных точек и обогащение жизнеспособных стареющих клеток путем проточной цитометрической сортировки.

Abstract

Клеточное старение - это состояние пролиферативной остановки, вызванное биологическим повреждением, которое обычно накапливается в течение многих лет в стареющих клетках, но также может быстро возникать в опухолевых клетках в ответ на повреждение, вызванное различными методами лечения рака. Старение опухолевых клеток, как правило, считается нежелательным, так как стареющие клетки становятся устойчивыми к смерти и блокируют ремиссию опухоли, усугубляя злокачественность опухоли и резистентность к лечению. Поэтому идентификация стареющих опухолевых клеток представляет постоянный интерес для сообщества исследователей рака. Существуют различные анализы старения, многие из которых основаны на активности хорошо известного маркера старения, бета-галактозидазы, связанной со старением (SA-β-Gal).

Как правило, sa-β-Gal проводится с использованием хромогенного субстрата (X-Gal) на фиксированных клетках, с медленным и субъективным перечислением «синих» стареющих клеток с помощью световой микроскопии. Улучшенные анализы с использованием проникающих в клетки флуоресцентных субстратов SA-β-Gal, включая C_12-FDG (зеленый) и DDAO-галактозид (DDAOG; дальний красный), позволили анализировать живые клетки и позволили использовать высокопроизводительные флуоресцентные аналитические платформы, включая проточные цитометры. C_12-FDG является хорошо документированным зондом для SA-β-Gal, но его зеленое флуоресцентное излучение перекрывается с внутренней клеточной автофлуоресценцией (AF), которая возникает во время старения из-за накопления агрегатов липофусцина. Используя дальний красный зонд SA-β-Gal DDAOG, зеленая клеточная автофлуоресценция может быть использована в качестве вторичного параметра для подтверждения старения, добавляя надежность анализу. Остальные флуоресцентные каналы могут быть использованы для окрашивания жизнеспособности клеток или необязательной флуоресцентной иммуномаркировки.

Используя проточную цитометрию, мы демонстрируем использование автофлуоресценции DDAOG и липофусцина в качестве двухпараметрического анализа для идентификации стареющих опухолевых клеток. Проводится количественное определение процента жизнеспособных стареющих клеток. При желании может быть включен необязательный этап иммуномаркировки для оценки интересующих антигенов клеточной поверхности. Идентифицированные стареющие клетки также могут быть цитометрически отсортированы и собраны для последующего анализа. Собранные стареющие клетки могут быть немедленно лизированы (например, для иммуноанализа или анализа омики) или дополнительно культивированы.

Introduction

Стареющие клетки обычно накапливаются в организмах в течение многих лет во время нормального биологического старения, но также могут быстро развиваться в опухолевых клетках в ответ на повреждение, вызванное различными методами лечения рака, включая лучевую и химиотерапию. Хотя опухолевые клетки больше не размножаются, вызванные терапией стареющие (ТИС) опухолевые клетки могут способствовать резистентности к лечению и вызывать рецидив ^1,2,3. Факторы, секретируемые клетками TIS, могут усугубить злокачественность опухоли, способствуя иммунному уклонению или метастазированию

Protocol

Все описанные работы с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Чикагском университете.

1. Подготовка и хранение стоковых растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки будут отсортированы потоком, все растворы должны быть приготовлены с использованием стерильных методов и отфильтрованы через фильтрующее устройство 0,22 мкм.

1. Готовят стандартный раствор DDAO-галактозида в дозе 5 мг/мл в ДМСО. Аликвота при 50 мкл на пробирку (или желаемый объем). Хранить при температуре −20 °C в темноте до 1 года.
2. Готовят стоковый раствор бафиломицина А1 ....

Results

Было проведено несколько экспериментов для демонстрации сопоставимости DDAOG с X-Gal и C_12-FDG для обнаружения старения SA-β-Gal. Во-первых, X-Gal использовался для окрашивания стареющих клеток меланомы B16-F10, индуцированных ETO (рисунок 2A). Интенсивный синий цвет развился в подмножестве клеток, обработанных ETO, в то время как другие клетки демонстрировали менее интенсивное синее окрашивание. Морфология была увеличена в большинстве клеток, обработанных ETO. Окрашивание клеток,.......

Discussion

За последнее десятилетие или около того, проточная цитометрия стала более распространенной платформой для анализа в исследованиях рака из-за растущей популярности иммунологии опухолей, разработки более дешевых проточных цитометров и улучшения общих инструментальных средств в академических учреждениях. Многоцветные анализы теперь являются стандартными, так как большинство новых инструментов оснащены фиолетовыми, сине-зелеными и красными и дальнекрасными оптическими массивами. Таким образом, этот протокол DDAOG, вероятно, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Бафиломицин А1	Исследовательские продукты Интернэшнл	B40500
Блеомицина сульфат	Cayman	13877
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	US Biological	A1380
Кальцеин Фиолетовый 450 AM краситель жизнеспособности	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 антитело, конъюгат ПЭ	Biolegend	137803	клон H194-112
Клеточная линия: A549 аденокарцинома легкого человека	Американская коллекция типовых культур	CCL-185
Клеточная линия: B16-F10 мышиная меланома	American Type Culture Collection	CRL-6475
Скребок	для клеток Corning	3008
Клеточные фильтры, 100 & микро; m	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Доксорубицин, гидрохлорид для инъекций (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Доксорубицин, ПЭГилированный липосомальный (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Этопозид	Кайман	12092
FBS	Омега	FB-11
Реактив блокирования рецепторов Fc	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Проточный цитометр (анализатор клеток)	Бектон Дикинсона (BD)	Различные	LSRFortessa
Проточный цитометр (сортировщик клеток)	Бектон Дикинсона (BD)	Различные	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 М	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Параформальдегид 16%	Электронная микроскопия	Sciences 15710
Пенициллин/стрептомицин 100x	Life Technologies	15140122
Фосфатный буферный раствор (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	PBS Dulbecco (без кальция и магния)
Радужные калибровочные частицы, ультра комплект	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 &; m, 2E6/мл
RPMI-1640 средний 1x	Life Technologies	11875-119
Хлорид натрия 0,9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Программное обеспечение для сбора данных цитометра, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD для лицензирования
Программное обеспечение для анализа данных цитометра, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Свяжитесь с TreeStar для получения лицензии
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114