本文介绍了一种详细的免疫组织化学实验方案，用于在复杂组织中识别、验证和靶向具有功能相关性的半胱天冬酶（caspases）。
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方法文章
视网膜组织中免疫染色Caspase-9的定量分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
半胱天冬酶（caspase）家族已知可介导多种超出细胞死亡范围的细胞通路，包括细胞分化、轴突导向以及增殖。自从发现细胞死亡蛋白酶家族以来，人们一直在寻找可用于识别并拓展该家族特定成员在发育、健康及疾病状态下功能的研究工具。然而，目前许多广泛使用的商业化caspase工具对靶向的caspase并不具有特异性。在本报告中，我们阐述了采用一种新型抑制剂结合遗传学方法及免疫组织化学检测手段，在神经系统中识别、验证并靶向caspase-9的研究策略。具体而言，我们以视网膜神经元组织作为模型，用于识别和验证caspase的存在及其功能。该方法能够探究特定细胞类型中caspase-9的凋亡性与非凋亡性功能，并可推广应用于其他复杂组织及感兴趣的caspase分子。深入理解caspase的功能有助于拓展当前细胞生物学的知识体系，同时因其在疾病中的参与作用，也有助于发现潜在的治疗靶点。
引言
半胱天冬酶（caspase）是一类蛋白酶家族，参与调控发育过程中的细胞死亡、免疫反应以及疾病中的异常细胞死亡1,2。尽管已知在多种神经退行性疾病中半胱天冬酶家族成员会被激活，但明确具体是哪种半胱天冬酶驱动疾病病理过程仍具挑战性3。此类研究需要借助工具来识别、表征并验证各个半胱天冬酶家族成员的功能。从机制和治疗角度而言，区分出相关的特定半胱天冬酶至关重要，因为已有大量文献表明半胱天冬酶具有多种不同的生物学作用4,5。因此，若目标是通过靶向某种半胱天冬酶以获得治疗效益，则必须实现对相关家族成员的特异性靶向。传统检测组织中半胱天冬酶水平的技术包括蛋白质印迹法（western blotting）、酶活性检测以及荧光测定方法3,6。然而，这些方法均无法实现细胞特异性的半胱天冬酶水平检测，在某些情况下，裂解后的半胱天冬酶往往也无法通过传统的蛋白质分析方法被检测到。已知半胱天冬酶在同一组织中可发挥凋亡性和非凋亡性等多种功能7，因此，准确理解发育和疾病相关通路，需要对细胞特异性的半胱天冬酶水平进行细致的表....
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方案
本方案遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。啮齿类动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准并接受其监督。
1. 视网膜组织的制备与冷冻切片
- 通过腹腔注射麻醉剂（氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg））处死动物，并使用蠕动泵对接受视网膜静脉阻塞（RVO）处理的小鼠进行4%多聚甲醛（PFA）灌注固定。
注意：在实施安乐死和灌注前，应通过夹趾反应确认动物麻醉深度。有关灌注的详细信息，请参见8。更多灌注操作细节可参考16。 - 使用镊子小心摘除眼球，并将眼球置于1 mL 4% PFA中，于4 °C条件下过夜固定。随后用1 mL 1×PBS洗涤三次，每次10分钟，并将样本置于摇床上振荡洗涤。
- 将眼球浸入1 mL 30%蔗糖溶液中，持续3天，直至眼球沉降至管底，表明蔗糖已充分渗透。
- 使用30 G注射器向眼球内注入最佳切割温度包埋剂（OCT），直至眼球呈现圆形（约注入50 µL）。
- 将眼球置于冷冻模具中，用OCT包埋至完全覆盖，并于-80 °C冷冻，待进行冷冻切片时取出。
- 使用恒冷切片机将包埋的眼球组织以20 µm厚度切片并贴附于载玻片上....
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结果
本方案可使用户分析并定量视网膜组织中的caspase-9水平。此外，该方案还提供了进一步识别、验证及特异性靶向caspase-9及其下游底物的工具。所总结的步骤可对荧光显微照片中的caspase水平及细胞特异性进行可量化的分析。所有图示均展示了未损伤及损伤后1天P-RVO视网膜横切面中总视网膜、内皮细胞和神经元内指定caspase水平的代表性荧光显微图像及定量结果。当使用Hoechst染色时，视网膜横切面可清晰显示视网膜节细胞层（RGL）、内核层（INL）和外核层（ONL）中的视网膜细胞核。此外，视网膜血管可见于视网膜网状层，或位于RGL与INL之间以及INL与ONL之间。由于血管的组织学特性，当视网膜被切片时，血管表现为不连续且分离的结构，分布于网状层中以提供血液供应。图2显示caspase-9在损伤后1天的P-RVO中受到高度调控。图3通过使用可诱导的内皮细胞敲除小鼠验证了内皮细胞中caspase-9的功能相关性。图4表明，通过药物学手段靶向活化的casp.......
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讨论
Caspase 是一个由多个成员组成的蛋白酶家族，其在细胞死亡和炎症中的作用已被广泛研究；然而，最近发现该家族中的一些成员还具有多种非死亡相关功能4,5。目前对 Caspase 功能的大部分认识主要来源于细胞培养实验以及人类疾病中的推断性数据。尽管已知在疾病状态下存在 Caspase 的异常诱导、激活或失活，但要从功能上明确 Caspase 是否驱动疾病病理过程仍具挑战性。许多用于检测特定 Caspase 的工具会同时识别多个家族成员，从而削弱了使用这些试剂所获得数据的功能相关性17。本文提供了一种在复杂组织中研究 Caspase 的实验方案，并以视网膜为例进行说明。在神经系统中，Caspase 的表达在出生前和出生后均呈下调状态，这使得可利用特异性抗体检测疾病模型中 Caspase 水平的变化。
尽管本实验方案的重点在于图像处理与分析，但该技术的成功还依赖于细致的组织制备、免疫组织化学（IHC）以及显微成像，以确保数.......
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披露
作者声明存在以下竞争利益：C.M.T. 拥有以下专利申请：US20200164026、US20190142915 和 US20150165061。C.M.T. 与 S.S. 共同拥有一项专利申请 US 20140024597。C.M.T.、A.M.P. 和 M.I.A. 共同拥有一项专利申请 US2020058683。C.M.T. 与 Y.Y.J. 共同拥有一项专利申请 WO2018013519。M.I.A. 和 C.M.T. 被列为纽约市哥伦比亚大学受托人提交的专利申请 WO/2020/223212 的发明人。其余作者声明不存在竞争利益。
致谢
本工作获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（NSF-GRFP）资助号 DGE - 1644869，以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）的资助，资助编号为 F99NS124180 NIH NINDS 多样性专项 F99（授予 CKCO），国家眼科研究所（NEI）5T32EY013933（授予 AMP），国家神经疾病与卒中研究所（RO1 NS081333、R03 NS099920，授予 CMT），以及美国国防部陆军/空军（DURIP，授予 CMT）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | 使用比例为 1:150 |
| 抗裂解型 Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | 使用比例为 1:800 |
| 抗 CD31 | BD Pharmingen | 553370 | 使用比例为 1:50 |
| 共聚焦转盘显微镜 | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | 开源软件 | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| 镊子 | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL × VECad-CreERT2 小鼠 | 实验室构建 | 参见 Avrutsky 2020 | |
| 异凝集素（594, 649） | Vector | DL-1207 | 使用比例为 1:200 |
| 盐酸氯胺酮 | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| 灌注泵 | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | 实验室构建 | 参见 Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| 赛拉嗪 | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
参考文献
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y.
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重印与许可
