本文展示了一种利用流式细胞术对药物载体与细胞相互作用进行绝对定量的工作流程，以实现对新型药物递送系统更合理的评估。该工作流程适用于任何类型的药物载体。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
设计药物递送系统的一个关键方面是如何增强或减弱与特定细胞类型的相互作用。例如，可将化疗药物与抗体结合，以增强其与癌细胞的结合能力（"靶向"），或与聚乙二醇结合，以帮助其逃避免疫细胞的识别（"隐形"）。即使在细胞层面，优化药物载体与细胞的结合及摄取效率也是一个复杂的生物学设计问题。因此，将新型载体与细胞相互作用的强度与其递送至细胞后所携带药物的功能性效果区分开来加以研究，具有重要意义。
以化疗为例， "与癌细胞的结合能力如何" 与……是两个不同的问题 "它杀死癌细胞的效果如何"定量 体外 然而，后者的检测方法已较为成熟，通常依赖于细胞活力的测定。但目前大多数关于细胞与载体相互作用的研究仍为定性或半定量性质。这些测量通常依赖于对载体进行荧光标记，因而所得结果以相对单位或任意单位表示与细胞的相互作用。然而，通过少量表征实验，此类研究可实现标准化并达到绝对定量。这种绝对定量具有重要价值，因为它有助于对各类药物递送系统——包括纳米颗粒、微粒、病毒、抗体-药物偶联物、工程化治疗性细胞或细胞外囊泡——进行合理且跨类别及同类内的比较。
此外，定量分析是后续进行荟萃分析的前提条件 计算机模拟 建模方法。本文中，视频指南以及决策树展示了如何实现 体外 针对载药递送系统的定量分析方法，本文提出了考虑载体尺寸和标记方式差异的评估策略。此外，还探讨了对先进药物递送系统进行定量评价的其他关键因素。本内容旨在为下一代药物的合理评估与设计提供有价值的参考。
引言
针对不同细胞类型表现出特定设计行为的药物递送系统构建已引起广泛的研究关注。潜在的药物递送系统构建体或"载体"包括脂质制剂、纳米级无机材料、聚合物组装体、细胞外囊泡、功能化细菌细胞或修饰病毒。这些载体均可因物理特性、表面特性或通过工程化学修饰（如抗体连接）而表现出器官、组织或细胞特异性1,2。
几乎所有实验中普遍存在的步骤 体外 载体评价是将细胞与含有载药载体的悬浮液共同孵育。孵育结束后，测定载体的性能表现。 通过 药物载荷性能的功能性读数，例如转染效率或毒性。功能性读数很有用，因为它们能够反映载体有效性的下游效应。然而，对于更复杂的药物递送体系，仅依赖功能性读数已不足够，有必要进一步单独量化载体与目标细胞相互作用的程度。原因如下。
首先，人们日益关注发现（并不断改进） "平台" 载体技术能够携带多种货物。例如，设计用于包封RNA的脂质纳米颗粒（LNPs）可在仅有少量限制的情况下，将一种RNA序列替换为另一种3因此，为了迭代优化载体技术，关键在于独立于货物功能来量化载体的性能。其次，对于特定的货物，其功能读出可能并不直接，这会削弱快速迭代和评估载体配方的能力。虽然可以进行 体外
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 选择合适的流
- 按照 图1 中的决策树确定适用于所用实验设置的最佳工作流程（流程路径）（图2）。有关该流程路径选择的进一步说明，请参阅讨论部分。
- 若采用流式细胞仪流程路径，请继续执行步骤 2.1.1–2.2.7；若采用群体分析流程路径，请继续执行步骤 3.1.1.1–3.1.5.7。
图1：工作流程决策树。 选择使用哪个流程主要取决于目标载体类型。体积较大或具有高散射特性的载体在流式细胞仪上更容易被单独检测，因此适用于通过流式细胞仪流程进行定量分析。其他所有类型的载体均适用于整体流程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
如前所述，不同类型的药物载体需要采用不同的技术来绝对定量细胞与载体的结合。例如，633 nm二硫键稳定的聚甲基丙烯酸（PMASH）核壳颗粒体积较大且密度较高，可利用高灵敏度流式细胞仪进行检测。因此，这些颗粒经荧光标记后，通过侧向角光散射（SALS，类似于SSC）以及相应的荧光通道进行设门并计数（图3）。两个通道中事件计数的差异为1.98%，在可接受范围内。
相比之下，100 nm的超顺磁性氧化铁纳米颗粒过小，无法单独检测，因此采用体相流（Bulk Stream）进行分析。这些纳米颗粒通过纳米颗粒追踪分析进行计数和表征（图4）。136 nm的平均纳米颗粒尺寸反映了该纳米颗粒在水中的流体动力学直径。测得的纳米颗粒浓度——尚未校正稀释操作的影响——处于仪器的动态范围之内，表明纳米颗粒浓度的测定成功且准确。
在批量流中继续进行时，需将载体悬浮液的绝对荧光强度转换为用于最终细胞-载体孵育的流式细胞.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
表征药物载体与细胞之间的相互作用在新型药物递送系统的开发中正变得日益重要。具体而言，为了能够合理地评估和比较各种载体结构，对载体与靶细胞及非靶细胞相互作用能力进行绝对定量至关重要。本实验方案描述了一种双流式方法，可使任何使用药物载体的研究人员将关于细胞-载体结合的相对性、半定量流式细胞术数据转化为绝对定量结果。所述方法适用于任何类型的载体——无论其尺寸大小、有机或无机——只要这些载体经过荧光标记即可。然而，不同载体在计算每细胞载体数量时需要采用不同的方法，这取决于进行必要表征测量所用仪器的各项技术限制。
因此，本实验方案分为两个流程：流式细胞仪流程和整体分析流程。其中，流式细胞仪流程更为直接，仅需使用流式细胞仪即可完成，但该流式细胞仪必须具备足够的灵敏度以检测所用的单个药物载体；换句话说，所关注的药物载体必须具有足够大的尺寸和密度，以便被检测到。整体分析流程则适用于任何类型的载体，因为它通过采用其他仪器避免了对单个载体的检测需求。然而，整体分析流程需要进行更多的表征实验。
为了帮助选择合适的流程（以及相应的技术），上述考虑因素.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC；项目资助号 GNT1149990）、澳大利亚艾滋病和肝炎病毒学研究中心（ACH2）以及Réjane Louise Langlois 遗产捐赠资助。F.C. 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）高级首席研究员奖学金（GNT1135806）的支持。图1 和 图2 使用 BioRender.com 制作。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH稳定的染料，用于标记150 nm、235 nm或633 nm的PMASH载体；适用于细胞-载体结合研究的优良染料示例 |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | 灵敏的流式细胞仪，可检测用于计数的小型载体 | |
| CytoFLEX S 流式细胞仪 | Beckman Coulter | 灵敏的流式细胞仪，可用于检测小型载体以进行计数，并用于最终细胞-屏障实验的数据读取 | |
| FCS Express | De Novo Software | 用于分析流式细胞术数据的软件，例如进行设门并获取所选群体的中位荧光强度值。替代软件包括FlowJo、OMIQ、Python等 | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | 标准微孔板读板仪，用于溶液中载体的总体荧光测量 | |
| LSRFortessa 细胞分析仪 | BD Biosciences | 灵敏度较低但更广泛可用的流式细胞仪，可用于读取最终的细胞-载体实验结果 | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 用于纳米颗粒追踪分析的仪器 | |
| Prism 8 | GraphPad | 用于绘制图表和计算标准曲线的软件。替代软件包括Microsoft Excel、Origin、Minitab、Python等 | |
| Quantum MESF试剂盒 Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | 用于流式细胞术的绝对定量微球，可将微孔板读板仪上测得的总体荧光强度转换为基于MESF标准的流式细胞仪测得的荧光强度 |
参考文献
- Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48(2014).
- Cheng, Q., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
