Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Живая визуализация ранних сердечных предшественников в эмбрионе мыши

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64273

⸱

12 июля 2022 г.

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Regeneration Program, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Cardiovascular Development Group, Department of Experimental Biology, University of Jaén, Jaén, 3Fundación Medina, Granada

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем подробный протокол культивирования и визуализации эмбрионов мышей, который позволяет выполнять 3D+ временную визуализацию клеток-предшественников сердца. Этот видеоинструментарий посвящен ключевым навыкам, необходимым для успешной визуализации в реальном времени, которые в противном случае трудно получить из текстовых публикаций.

Аннотация

Первые шаги развития сердца подразумевают резкие изменения в поведении и дифференцировке клеток. В то время как анализ фиксированных эмбрионов позволяет детально изучить конкретные стадии развития на неподвижном снимке, живая визуализация фиксирует динамические морфогенетические события, такие как миграция клеток, изменения формы и дифференцировка, путем визуализации эмбриона по мере его развития. Это дополняет фиксированный анализ и расширяет понимание того, как развиваются органы во время эмбриогенеза. Несмотря на свои преимущества, живая визуализация редко используется в моделях мышей из-за ее технических проблем. Ранние эмбрионы мышей чувствительны при культивировании ex vivo и требуют эффективного обращения. Чтобы облегчить более широкое использование визуализации в реальном времени в исследованиях развития мышей, в этой статье представлен подробный протокол двухфотонной живой микроскопии, который позволяет проводить долгосрочные исследования в эмбрионах мышей. В дополнение к протоколу предоставляются советы по обращению с эмбрионами и оптимизации культивирования. Это поможет понять ключевые события в раннем органогенезе мышей, углубляя понимание биологии сердечно-сосудистых предшественников.

Введение

Сердце формируется рано во время эмбриогенеза, чтобы начать перекачивать питательные вещества ко всему эмбриону, в то время как оно продолжает развиваться1. У мышиных эмбрионов через полтора дня после начала гаструляции на переднем полюсе 2,3 собирается рудиментарный орган сердца. На ранней стадии полосы (ES) сердечные предшественники в эпибласте проникают через примитивную полосу в зарождающийся мезодермальный слой 4,5,6 и начинают мигрировать к переднему полюсу, где они дифференцируются, образуя примитивную сердечную трубку. На протяжении всего этого процесса ранние предшественники сердца претерпевают клеточные перестройки, трансформации формы и дифференцировку в дополнение к миграции7 (рис. 1).

Ранние сердечные предшественники привлекали исследователей в течение почти столетия из-за их замечательной способности дифференцировать и строить функциональный орган одновременно. За последние два десятилетия клональный анализ и модели условного нокаута показали, что раннее развитие сердца вовлекает различные источники клеток в высокодинамичный процесс 8,9,10. Однако 3D-структура примитивной сердечной трубки и динамический характер ее морфогенеза затрудняют ее изучение (рис. 1), и мы далеки от понимания всей ее сложности11.

Для изучения этих динамических клеточных процессов методы визуализации в реальном времени теперь предлагают беспрецедентную детализацию 7,12,13,14. В мышиной модели живые подходы были ключом к исследованию тем разработки, которые трудно решить с помощью статического анализа 7,13,15. В то время как долгосрочное культивирование ex vivo и надежные микроскопические установки быстро развиваются16,17, немногие исследователи имеют опыт для успешного изображения живых эмбрионов. Несмотря на то, что бумажные публикации предоставляют достаточно технических подробностей для воспроизведения экспериментов с визуализацией в реальном времени, некоторые навыки и приемы трудно понять без визуальных примеров или помощи коллег. Чтобы ускорить этот процесс обучения и распространить использование визуализации в реальном времени среди лабораторий, мы собрали видеопротокол (рис. 2), который собирает необходимые навыки для выполнения визуализации в реальном времени на эмбрионах мышей-гаструляций.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Ранняя дифференцировка клеток-предшественников сердца в эмбрионе мыши от начала гаструляции до стадии, предшествующей примитивному образованию сердечной трубки. Клетки-предшественники сердца проникают в мезодерму вскоре после начала гаструляции, мигрируя на противоположную сторону эмбриона. Морфологическая стадия и стадия эмбрионального дня (E) записываются поверх диаграмм. Пунктирными стрелками изображена траектория миграции примитивных прародителей сердечных трубок во время гаструляции. Эта цифра была адаптирована из11. Сокращения: ES = ранняя полоса; MS = средняя полоса; КВЧ = ранняя складка головы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Диаграмма рабочего процесса для визуализации ранних предшественников сердца в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных CNIC Мадридским сообществом (ссылка PROEX 220/15) и соответствовали Директиве ЕС 2010/63EU и Рекомендации 2007/526/EC относительно защиты животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, введенных в действие испанским законодательством в соответствии с Real Decreto 1201/2005.

Этот протокол включает в себя использование двух самцов из линии флуоресцентных трансгенных мышей, сообщающих об активности NOTCH Tg (CBF: H2BVenus, +) 18. Подробные сведения о материалах, животных и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Настройка инструментов и держателя

  1. Отрежьте кусочки вольфрамовой проволоки длиной 1 см и заточите их до диаметра 0,02-0,05 мм, используя любой из доступных простых способов, например, погрузив наконечник проволоки в насыщенный раствор нитританатрия 19.
  2. Подготовьте локтевые стеклянные капилляры.
    1. Поместите среднюю точку стандартного стеклянного капилляра диаметром 1,0 мм над зажигалкой Бунзена на 3-6 секунд, медленно оттягивая от обоих концов, пока капилляр не станет тонким и гибким. В этот момент разорвите капилляр пополам и кратковременно нагрейте его, чтобы получить изгиб на 90 ° в 2 см от кончика.
  3. Распилил кусок полиметилметакрилата размером примерно 7 мм в длину, 4 мм в ширину и 2 мм в толщину (рис. 3D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Листы из полиметилметакрилата можно либо получить из переработанного лабораторного оборудования, либо заказать новые.
  4. Удерживайте кусочек метакрилата с помощью скамьи тисками. Затем просверлите отверстия нестандартного размера поперечно через всю деталь (рис. 3D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, эмбрионы мышей от E6,5 до E7,5 требуют использования сверл диаметром 0,2-0,5 мм.
    1. Медленно вращайте дрель, применяя низкое, но постоянное давление. Если сверло сломалось внутри держателя, выбросьте кусок, так как металл нельзя вынуть.
  5. Используйте мелкий напильник, чтобы сгладить края держателя и отрегулировать его размер. Кроме того, создайте небольшой наклон по краям держателя, чтобы облегчить позиционирование эмбриона (рис. 3D).
  6. Готовый держатель поместите в посуду с дистиллированной водой, чтобы промыть его.
  7. Проверьте держатель под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что отверстия содержат сверлильную пыль. Если пыль присутствует, используйте вольфрамовые иглы для ее удаления.
  8. Чтобы стерилизовать держатель, поместите его в коническую трубку, наполненную дистиллированной водой, и обработайте ее ультразвуком в течение 20 минут с выходной мощностью не менее 20 Вт.

2. Подготовка СМИ

  1. Чтобы инактивировать систему комплемента, оставьте две аликвоты по 500 мкл коммерческой или самодельной сыворотки 20 крыс при 56 ° C в течение30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол приготовления сыворотки для крыс см.в разделе 21.
  2. В вытяжке для клеточной культуры приготовьте две аликвоты среды для культивирования эмбрионов в микроскопе. Для каждого из них смешайте 490 мкл DMEM для визуализации живых клеток, 500 мкл инактивированной сыворотки крыс и 10 мкл пенициллина-стрептомицина, чтобы получить конечную концентрацию 50 мкг/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем питательной среды зависит от времени и количества эмбрионов, подлежащих культивированию. Как правило, для оптимального роста требуется минимум 200 мкл на эмбрион в день у эмбрионов E7.0.
  3. Используя шприц объемом 2 мл, отфильтруйте среду через мембранный фильтр размером пор 0,22 мкм в новую пробирку и поместите ее с открытой крышкой в инкубатор клеточных культур при 37 ° C и 7% CO2 за 1 ч до культивированияэмбрионов 23.
  4. Приготовьте среду для рассечения, добавив в 500 мл DMEM, дополненный флаконом с L-глютамином, следующее: 50 мл эмбриональной бычьей сыворотки, 10 мл 25 мМ HEPES-NaOH (pH 7,2) и 10 мл пенициллина и стрептомицина (50 мг / мл).
  5. Затем разделите его на аликвоты по 50 мл, поместите три аликвоты в ванну с температурой 37 ° C, а остальные храните при температуре 4 ° C до 3 месяцев.

3. Рассечение эмбриона

  1. Усыпить беременную мышь E6.75-E7.5.
  2. Извлеките матку и положите ее на сухую и чистую бумажную салфетку. Затем разрежьте матку, вставив кончик тонких ножниц со стороны мезометрии и проведя лезвием вдоль, чтобы обнажить лиственницы и перенести их в среду для рассечения. Подробный протокол см.в разделе 24.
  3. Препарируют эмбрионы, сохраняя эктоплацентарный конус нетронутым (рис. 3А, Б). Подробный метод вскрытия см.в пункте 25.
  4. Затем снимите мембрану Рейхерта, оставив часть ее на внезародышевой области (рис. 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкие щипцы необходимы для этого шага. Неопытные пользователи могут препарировать эмбрионы на 2% агарозной посуде, покрытой гелем, чтобы не сгибать кончики щипцов о поверхность посуды (рис. 3C).
  5. Чтобы диссекция оставалась средней, заменяйте ее каждые 10 минут. Кроме того, препарируйте листопады группами по 3-4 штуки, а остальные храните в диссекционной среде, помещенной в ванну с температурой 37 °C. Немедленно поместите рассеченные эмбрионы в питательную среду.
  6. С помощью флуоресцентного стереомикроскопа отбирают эмбрионы с желаемыми флуоресцентными свойствами и помещают их в пробирку с питательной средой в инкубаторе клеточных культур.
  7. Если эмбрионы находятся на стадиях от E6,5 до E7,0, закройте крышку и оставьте эмбрионы для восстановления в течение 2 часов перед визуализацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы от E6.5 до E7.0 чувствительны. Они также могут быть помещены непосредственно под микроскоп, но предварительное культивирование позволяет выбрать те, которые лучше всего восстанавливаются после вскрытия, увеличивая шансы на успех.

4. Подготовка микроскопа

  1. Включите все компоненты микроскопа, включая лазеры, компьютер и программное обеспечение. Включите регуляторы температуры и установите 37 °C за 3 часа, чтобы обеспечить равновесие.
  2. Если вы используете объектив обнаружения погружения, очистите его одноразовой салфеткой без остатка. Окуните наконечник объектива в дистиллированную воду с помощью 60-миллиметровой посуды и оставьте до начала захвата.
  3. Включите контроллер CO2 и установите его на 7%.
  4. Нанесите каплю высоковакуумной силиконовой смазки на чашку диаметром 35 мм со стеклянным покровным дном (диаметр 14 мм), поместите держатель поверх капли и осторожно надавите, чтобы обездвижить ее.
  5. Под стереомикроскопом добавьте питательную среду, чтобы заполнить стеклянную нижнюю часть блюда. При этом направляйте струю на отверстия держателя, чтобы предотвратить образование в них пузырьков воздуха.
  6. Если пузырьки остались, используйте стеклянный капилляр, подготовленный на шаге 1.2, соединенный с силиконовой трубкой с мундштуком, чтобы аккуратно отсосать пузырьки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Локтистый конец капилляра облегчит доступ через отверстия.

5. Крепление эмбриона

  1. Перенесите 2-3 эмбриона, которые были оставлены для восстановления в инкубаторе, в чашку с держателем. Остальное оставьте в инкубаторе в качестве резервного.
  2. Установите эмбрионы в отверстия с помощью пары щипцов и конической вольфрамовой иглы. Используйте иглу, чтобы зацепить эмбрион за эктоплацентарный конус и вставить его в отверстие, соответствующее размеру. Чтобы обездвижить зародыш, поверните конус на 90-120° так, чтобы мембрана Рейхтера прилипла к стенкам отверстия (рис. 3В). Альтернативное описание см.в пункте 26.
  3. Осторожно переместите чашку с эмбрионами и держателем на пластину микроскопа (рис. 3F, G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эмбрион не двигается устойчиво, он может выйти из держателя.
  4. Опустите объектив до тех пор, пока на границе раздела среднего объектива не образуется жидкий мениск.
  5. Найдите эмбрион с помощью проходящего света под бинокулем микроскопа и поместите эмбрион в фокус.
  6. Установите инкубационную камеру и заклейте ее вокруг объектива с помощью ленты (рис. 3F).
  7. Используя Live Capture в управляющем программном обеспечении микроскопа, отрегулируйте уровни выходного сигнала лазера и усиления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для двухфотонного получения зеленого флуоресцентного белка (GFP) и репортеров Tdtomato в этом протоколе использовалась 30% выходная мощность лазера на длине волны 980 нм и 70% коэффициент усиления на недесканированных детекторах (рис. 3G).
  8. Чтобы избежать испарения, покройте среду парафиновым маслом, медленно капая его на объектив.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это последняя точка, где дополнительные эмбрионы могут быть установлены в держатель. После покрытия парафиновым маслом для этого необходимо очистить держатель и заменить среду. Альтернативные способы монтажа см.в пункте 27.

6. Получение изображения

  1. Настройте покадровую съемку. Установите интервал времени 5-10 минут с z-интервалом 3-5 мкм между стеками. Оставьте пустое место в верхней части z-стека, чтобы предвидеть рост эмбриона, минимум 50 мкм, добавляя 30 мкм за каждый час, когда сбор не будет контролироваться.
  2. Если доступно, включите опцию «Автосохранение», чтобы разрешить наблюдение за получением с персонального компьютера, чтобы при необходимости можно было настроить размер z-стека в соответствии с интересующей областью в фокусе.

figure-protocol-1
Рисунок 3: Инструменты и настройка визуализации в реальном времени . (A) Препарирование эмбрионов мышей с помощью чашки, покрытой агарозой, под стереомикроскопом. (B) Схема этапов вскрытия эмбрионов мышей для получения изображений в реальном времени. (C) Размещение эмбриона в держателе. (D) Конструкция и особенности держателя эмбриона. (F) Камера инкубатора вокруг иммерсионного объектива. (G) Схема окончательной настройки для покадровой съемки. Масштабная линейка = 500 мкм (А). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы использовали протокол для визуализации активации сигналов NOTCH у ранних сердечных предшественников, которые должны были дифференцироваться в эндотелиальные клетки во время примитивного морфогенеза сердечной трубки. Для этого мы скрестили мышей дикого типа C57BL / 6-N с мышами Tg (CBF: H2BVenus, +)18 , чтобы получить эмбрионы, сообщающие об активности NOTCH через желтый флуоресцентный белок Venus. В E7.5 флуоресценция Венеры присутствует по всей нервной эктодерме, с несколькими положительными я...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ранние предшественники сердца организуются в примитивной сердечной трубке, которая начинает биться, пока она еще формируется. Понимание того, как происходит этот процесс, является ключом к точному определению широкого спектра врожденных пороков сердца до конкретных морфогенетических событий. Для этого живая визуализация дает возможность изучать нормальное и дефектное эмбриональное развитие с повышенным временным разрешением. Это особенно полезно для изучения ранних клеток-предшественников сердца, поскольку они быстро пер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность д-ру Кензо Ивановичу за предыдущую работу над этим методом и группе д-ра Сигэнори Нонака (Национальный институт естественных наук, Япония) за предоставление первоначальных знаний по монтажу эмбрионов. Это исследование было поддержано грантом PGC2018-096486-B-I00 от Министерства науки и инноваций Испании и грантом H2020-MSCA-ITN-2016-722427 от программы ЕС «Горизонт 2020» для MT и грантом 1380918 от операционной программы FEDER Andalucía 2014-2020 для JND. MS был поддержан стипендией PhD Фонда La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) и путешествующей стипендией Компании биологов (DEVTF181145). CNIC поддерживается Министерством науки Испании и Фондом ProCNIC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#55 ЩипцыDumont 11295-51
35 мм Посуда со стеклянным покровным дном 14 мм ДиаметрMattekP35G-1.5-14-C
35 мм Тиски стол GrandadoSKU 8798771617573
50 мл пробиркиBD Falcon352070
Дистиллированная вода
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11966025  с L-глутамином, без глюкозы, без Na пирувата
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen10438-026
Флуоресцентные репортеры трансгенных мышей (Tg(CBF:H2BVenus,+) JAX
Fluorobrite DMEMThermoFisherA1896701 DMEM для визуализации живых клеток
Высоковакуумная силиконовая смазкаDow CorningZ273554-1EA
Держатель для проводовPerlen Pressenpwb1
LSM 780 Вертикальный микроскопZeiss 
Инфракрасный импульсный лазер MaiTai Deepsee, настроенный на 980 нмSpectra-Physics
Неразсканированные детекторы, оснащенные наборами фильтров
голубовато-желтый (BP450-500/BP520-560), зелено-красный (BP500-520/BP570-610) и желто-красный (BP520-560/BP645-710)		Zeiss 
Объектив: 20x погружение в воду 1,0 NA, большое рабочее расстояниеZeiss 
Р1000 и Р200
Парафиновое маслоNidaconVNI0049
пенициллин-стрептомицинInvitrogen15070-063(конечная концентрация должна быть 50 мкм; г/мл пенициллина и 50 μ г/мл стрептомицина)
чашки Петри 35 мм x 10 ммBD Falcon351008
наконечники для пипеток
полиметилметакрилат Повторно использовано из старого лабораторного оборудования
Крысиная сыворотка культуры эмбриона, самцов крыс SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Набор мелких частиц 160 ммRS PRO541-6933
Стандартные стеклянные капилляры 1,0 ммAnima Lab  1В100Ф-3
Стерильный 0,22 мкм; m шприц фильтрCorning431218
стерильный шприц 5 млFisher Scientific15809152
вольфрамовые иглы
ультразвуковой гомогенизатор (ультразвуковой аппарат)BandelinBASO_17021
Пипетки

Ссылки

  1. Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113(2016).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750(2014).
  3. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  4. Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
  5. Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
  6. Lawson, K. A. Fate mapping the mouse embryo. International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).
  7. Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668(2017).
  8. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
  9. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  10. Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888(2014).
  11. Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5(2022).
  12. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  13. Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434(2019).
  14. Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506(2013).
  15. Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
  16. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  17. Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
  18. Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15(2013).
  19. Cold Spring Harbor Protocols. Sharpened tungsten needles. Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).
  20. Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
  21. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593(2011).
  22. Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
  23. González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
  24. Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814(2014).
  25. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160(2006).
  26. Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
  27. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595(2011).
  28. Crainiciuc, G., et al. Behavioural immune landscapes of inflammation. Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Развитие сердцадвухфотонная микроскопиякультивирование эмбрионовдиссекция эмбрионовтаймлапс-визуализацияфлуоресцентная микроскопияэндотелиальные предшественники
Живая визуализация ранних сердечных предшественников в эмбрионе мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.